생체 재료에 대한 세포 독성 및 세포 반응에 접근

이 방법론은 유세포 분석, RT-PCR, 면역세포화학, 기타 세포 및 분자 생물학 기술을 포함한 생존력 분석 및 표현형 분석을 사용하여 가용성 추출물의 제조를 통해 생체 재료 세포 독성을 평가하는 것을 목표로 합니다.

생체 재료는 인체 조직과 직간접적으로 접촉하므로 세포 독성을 평가하는 것이 중요합니다. 이 평가는 여러 가지 방법으로 수행 할 수 있지만 사용 된 접근법간에 높은 불일치가 존재하여 재현성과 얻은 결과 간의 비교가 손상됩니다. 본 논문에서는 치과용 생체재료에 사용하는 수용성 추출물을 이용하여 생체재료 세포독성을 평가하는 프로토콜을 제안한다. 추출물 준비는 펠렛 생산에서 배양 배지에서의 추출에 이르기까지 자세히 설명되어 있습니다. 생체 재료 세포 독성 평가는 MTT 분석을 사용한 대사 활성, Sulphorhodamine B(SBR) 분석을 사용한 세포 생존율, 유세포 분석에 의한 세포 사멸 프로파일, May-Grünwald Giemsa를 사용한 세포 형태를 기반으로 합니다. 세포독성 평가에 추가하여, 세포 기능을 평가하기 위한 프로토콜은 면역세포화학 및 PCR에 의해 평가된 특정 마커의 발현을 기반으로 설명된다. 이 프로토콜은 추출물 방법론을 사용하여 재현 가능하고 강력한 방식으로 생체 재료 세포 독성 및 세포 효과 평가를 위한 포괄적인 가이드를 제공합니다.

생체적합성은 조직을 통합하고 국소 및 전신 손상이 없는 유리한 치료 반응을 유도하는 물질의 능력으로 정의할 수 있다 ^1,2,3. 생체 적합성 평가는 의료용 재료의 개발에 매우 중요합니다. 따라서 이 프로토콜은 새로운 생체 재료 개발을 목표로 하거나 기존 생체 재료에 대한 새로운 응용 프로그램을 연구하는 모든 연구자에게 체계적이고 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.

시험관 내 세포 독성 시험은 일차 세포 배양 또는 세포주를 사용하여 생체 적합성 평가의 첫 번째 단계로 널리 사용됩니다. 결과는 잠재적인 임상 적용의 첫 번째 지표를 구성합니다. 이 테스트는 생체 재료 개발에 필수적일 뿐만 아니라 EUA 및 EU 규제 기관(FDA 및 CE 인증)4,5,6,7,8의 시장 도입에 대한 현재 규정을 준수해야 합니다. 또한, 생물의학 연구의 표준화된 시험은 유사한 생체 재료 또는 장치에 대한 다양한 연구 결과의 재현성 및 비교 측면에서 상당한 이점을 제공한다⁹.

ISO(International Organization for Standardization) 지침은 정확하고 재현 가능한 방식으로 재료를 테스트하기 위해 여러 독립적인 상업, 규제 및 학술 실험실에서 널리 사용됩니다. ISO 10993-5는 시험관 내 세포 독성 평가를 의미하며 ISO 10993-12는 샘플링 제제^10,11에 보고합니다. 생체 재료 테스트를 위해 재료 유형, 접촉 조직 및 치료 목표에 따라 선택되는 세 가지 범주가 제공됩니다 : 추출물, 직접 접촉 및 간접 접촉 8,11,12,13. 추출물은 세포 배양 배지를 생체 재료로 풍부하게 하여 얻는다. 직접 접촉 시험을 위해, 생체 재료를 세포 배양물 상에 직접 위치시키고, 간접 접촉에서, 세포와의 인큐베이션은 아가로스 겔(¹¹)과 같은 장벽에 의해 분리되어 수행된다. 적절한 통제가 필수적이며 최소 3 개의 독립적 인 실험이 수행되어야합니다 5,8,10,11,14.

세포 독성 가능성을 결정하기 위해 임상 조건을 시뮬레이션하거나 과장하는 것이 중요합니다. 추출물 테스트의 경우 재료의 표면적;  중간 볼륨; 배지 및 물질 pH; 물질 용해도, 삼투압 및 확산 비율; 교반, 온도 및 시간과 같은 추출 조건은 배지 농축제에 영향을 미칩니다⁵.

이 방법론은 고체 및 액체의 여러 제약 제형의 세포 독성에 대한 정량적 및 정성적 평가를 허용합니다. 중성 적색 흡수 시험, 집락 형성 시험, MTT 검정 및 XTT 검정 5,10,14와 같은 여러 검정을 수행할 수 있습니다.

발표된 대부분의 세포독성 평가 연구는 제한된 정보를 제공하는 MTT 및 XTT와 같은 더 간단한 분석을 사용합니다. 생체적합성 평가는 세포독성의 평가뿐만 아니라 주어진 시험 물질²의 생체활성의 평가를 포함해야 한다. 정당화되고 문서화된 경우 추가 평가 기준을 사용해야 합니다. 따라서 이 프로토콜은 생체 재료 세포 독성 평가를 위한 일련의 방법을 자세히 설명하는 포괄적인 가이드를 제공하는 것을 목표로 합니다. 게다가, 다양한 세포 과정, 즉 세포 사멸의 유형, 세포 형태, 특정 단백질 합성에서의 세포 기능 및 특정 조직 생산에 대한 평가가 설명됩니다.

1. 펠렛 준비

1. PVC 플레이트에 알려진 치수의 원형 구멍을 수행하여 폴리염화비닐(PVC) 몰드를 준비합니다.
   알림: PVC 몰딩은 다양한 크기로 만들 수 있습니다. 공식 A= h(2πr)+2πr² (r: 원통의 반지름, h: 원통의 높이)를 사용하여 PVC 몰드의 접촉면을 계산합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 테스트 할 생체 재료를 준비하십시오.
   참고: 페이스트/페이스트 제형 바이오 재료의 준비를 위해 적절한 양의 베이스 페이스트와 촉매를 혼합 주걱으로 수동으로 혼합합니다. 액체 및 분말 제형을 기반으로 하는 다른 재료의 경우 제조업체의 지침에 따라 또는 적절한 새 재료에 따라 수동 스패테이션 또는 진동과 기계적 혼합을 수행해야 합니다. 액체 재료의 경우 이 단계가 필요하지 않습니다. 2단계에서 프로토콜을 시작합니다.
3. 주걱으로 생체 재료를 금형에 놓고 적절한 시간 동안 고정시킵니다.
   알림: 생체 재료의 경화 시간 및 경화 조건은 제조업체의 지침을 따르거나 새로운 재료에 적합해야 합니다.
4. 설정 후, PVC 몰드에서 생체 재료의 펠릿을 제거하고 용기에 넣습니다(6웰 플레이트 또는 페트리 접시 사용 가능).
5. 펠릿을 자외선 (UV) 램프 아래에 두어 각 면에 대해 20분 동안 소독합니다.

2. 생체 재료의 추출물 얻기

알림: 모든 절차는 엄격한 멸균 조건에서 수행해야 합니다.

1. 1.1에 설명된 공식에 따라 펠릿 표면적을 계산하여 필요한 펠릿 수를 결정합니다.
   참고: 기준 값으로, 250 mm²/mL^11,15의 접촉 표면적은 배지 mL당 9개의 펠릿(r 3 mm x h 1.5 mm)을 추가하여 달성됩니다.
2. 가용성 추출물(생체 재료가 풍부한 추출물)을 준비합니다.
   1. 펠릿을 50mL 튜브에 넣고 해당 세포 배양 배지를 추가합니다. 튜브를 37°의 인큐베이터에 24시간 동안 일정한 회전으로 놓습니다.
      참고: 세포 배양에 적합한 세포 배양 배지를 사용하십시오.
   2. 24 시간 후 인큐베이터에서 튜브를 꺼냅니다. 이 시점에서, 추출물은 1/1 또는 100%의 농도에 상응한다.
   3. 동일한 부피의 컨디셔닝 배지를 세포 배양 배지에 순차적으로 첨가하여 추출물을 희석합니다.
      알림: 매체에 pH를 조정해서는 안 됩니다.
      1. 100% 추출물 1mL에 배양액 1mL를 가하여 50% 추출물을 얻었다. 50% 추출물 1mL에 배양액 1mL를 추가하여 25% 추출물을 얻는 식입니다(그림 1).
         참고: 각 화합물과 관련된 농도를 사용하십시오.

그림 1: 가용성 추출물의 준비 및 희석 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 생체 재료 추출물을 사용한 세포 배양

1. 세포 현탁액을 준비하고, 실험에 필요한 세포의 수에 따라 멀티웰 플레이트와 같은 적절한 세포 용기에 플레이트한다.
   1. 80%에서 90%의 합류점으로 원하는 세포의 플라스크로 시작합니다.
   2. 세포 배양 배지를 버리고, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 트립신 EDTA (75^cm2 세포 배양 플라스크에 대해 1 내지 2 mL)로 세포를 분리한다.
   3. 세포 배양 배지 (75^cm2 세포 배양 플라스크에 대해 2 내지 4 mL)를 첨가하고, 세포 현탁액을 튜브로 옮기고, 200 x g 에서 5 분 동안 원심분리한다.
   4. 펠렛을 알려진 부피의 세포 배양 배지에 현탁시킵니다.
      참고: 이 프로토콜은 부착 세포 배양의 사용을 위해 설계되었습니다. 그러나 현탁 세포 배양과 함께 작동하도록 간단한 적응을 할 수 있습니다.
   5. 혈구계에서 세포를 세고 세포 현탁액의 세포 농도를 계산합니다.
   6. 결정된 양의 세포 현탁액을 배양액에 현탁하고 멀티웰 디쉬로 옮깁니다. 파종 밀도의 기준 값으로 5 – 20 x 10⁵ cells/cm²를 고려하십시오.
      알림: 적절한 셀 수는 셀 유형 및 셀 특성, 즉 셀 배가 시간에 따라 계산해야 합니다.
2. 세포가 부착될 수 있도록 세포를 24시간 동안 인큐베이션한다.
3. 이 기간이 지나면 가용성 추출물을 배양 플레이트에 투여합니다.
   1. 세포 배양 배지를 흡인합니다.
   2. 앞에서 설명한 대로 농도 순서에 따라 각 웰에 생체 재료의 추출물을 추가합니다. 새로운 세포 배양 배지를 대조군 웰에 추가합니다.
   3. 플레이트를 24시간 이상 배양합니다.
      참고: 음성 대조군은 배양 배지에서 유지되는 처리되지 않은 세포에 해당하는 각 분석에서 수행해야 합니다. 배양 시간은 연구 목표에 따라 선택할 수 있습니다.

4. 대사 활성의 평가

1. 생체 재료 추출물과 함께 세포를 배양한 후 플레이트에서 배지를 흡인하고 각 웰 PBS를 세척합니다.
2. 각 웰에 PBS, pH 7.4에서 준비한 0.5mg/mL 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸 브로마이드(MTT)의 적절한 부피를 넣습니다.
3. 플레이트를 37°C의 어둠 속에서 4시간 또는 하룻밤 동안 배양한다.
4. 얻어진 포르마잔 결정을 가용화하기 위해, 이소프로판올 중의 0.04 M 염산 용액의 적절한 부피를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 교반한다.
   알림: 우물의 크기에 따라 MTT와 이소프로판올의 양을 조정하십시오.
5. 필요한 경우 결정이 보이지 않을 때까지 위아래로 피펫팅하여 각 웰의 내용물을 저어주고 균질화합니다.
6. 분광광도계에서 620nm 기준 필터를 사용하여 570nm 파장의 흡광도를 정량화합니다.
7. 대사 활성을 계산하기 위해, 처리된 세포의 흡광도를 대조 배양물의 흡광도로 나눕니다. 백분율 값을 얻으려면 100을 곱하십시오.

5. 세포사멸 평가

알림: 이 평가를 수행하려면 조건당 최소 10개의⁶ 개 셀을 사용해야 합니다.

1. 평가 중인 조건에 따라 적절하게 식별된 원심분리기 튜브를 사용하십시오.
2. 생체 재료 추출물과 함께 세포 배양 후 배양 배지를 각 튜브에 수집합니다.
3. 세포를 분리하고 세포 현탁액을 각 튜브에 추가합니다.
4. 세포 현탁액을 120 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 농축한다.
5. 펠릿을 PBS로 세척하십시오. PBS를 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다.
6. PBS 1mL를 넣고 세포 펠릿을 확인된 세포분석 튜브에 옮깁니다.
7. PBS를 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다.
8. 100 μL의 결합 완충액(0.01 M HEPES, 0.14 mM NaCl 및 0.25 mM CaCl₂)16과 함께 배양하고 세포막 회복을 위해 세포를 약 ¹⁵분 동안 휴지시킵니다.
9. 형광 표지 Annexin-V 2.5μL와 요오드화 프로피듐 1μL를 실온에서 어두운 곳에서 15분 동안 추가합니다.
10. 배양 후 400μL의 PBS를 추가하고 세포분석기에서 분석합니다. 정보의 분석 및 정량화를 위해서는 적절한 소프트웨어를 사용하십시오.
11. 살아있는 세포, 세포 사멸, 후기 세포 사멸 / 괴사 및 괴사의 백분율로 결과를 제시합니다.

6. 형태 평가

1. 멀티웰 플레이트 내부에 맞는 적절한 크기의 멸균 유리 커버슬립을 선택하십시오.
2. 멸균 핀셋을 사용하여 각 슬라이드를 우물에 넣습니다.
3. 적절한 농도의 세포 현탁액을 웰 내로 분배하고, 95% 공기 및 5%_CO2를 갖는 가습된 분위기 하에 37°C의 인큐베이터에서 밤새 방치한다.
4. 앞서 설명한 대로 세포 배양물을 추출물에 노출시킵니다.
5. 배지를 흡인하고 PBS로 세척하십시오.
6. 커버슬립을 실온에서 건조시킨 다음 커버슬립을 덮을 수 있는 충분한 양의 May-Grünwald 용액을 추가합니다. 3 분 동안 배양하십시오.
7. 염료를 제거하고 증류수로 1분간 세척한다.
8. 물을 제거하고 커버슬립을 덮을 수 있도록 충분한 양의 Giemsa 용액을 추가합니다. 15 분 동안 배양하십시오.
9. 흐르는 물에 커버슬립을 씻으십시오.
10. 커버슬립을 슬라이드로 옮깁니다.
11. 현미경으로 보십시오. 선택한 배율로 사진을 촬영합니다.

7. 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 세포기능 평가

알림: 이 평가를 수행하려면 조건당 최소 2x10⁶ 개의 셀을 사용해야 합니다. 예를 들어, 알칼리성 포스파타제는 치아세포 활성 평가를 위한 관심 유전자로 제시됩니다. 관심있는 다른 유전자는 표 1에서 볼 수 있습니다.

1. 위에서 설명한 대로 세포를 플레이트합니다.
   참고: 도금된 세포의 농도는 연구 중인 생체 재료의 세포 유형 및 세포 독성에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
2. 위에서 설명한 대로 가용성 추출물과 함께 배양합니다.
3. 세포를 분리하여 앞에서 설명한 바와 같이 현탁액을 얻습니다.
4. 세포를 PBS로 2회 세척하고; 이 원심분리기를 200 x g에서 실온에서 5분 동안 처리한다.
5. 펠릿을 1 mL의 RNA 정제 용액 (예를 들어, NZYol)에 현탁시키고, 강렬하게 교반하고, 연속적인 피펫팅하여 세포를 용해시킨다.
6. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
7. 클로로포름 200 μL를 넣고 튜브를 손으로 15 초 동안 흔든다.
8. 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
9. 원심분리기는 12,000 x g에서 15분 동안 4°C에서 용해됩니다. 이 원심분리 동안 샘플에서 두 단계가 발생하여 RNA가 수성(상부) 상에 남게 됩니다.
10. 수성상을 새 튜브로 제거하고 500μL의 차가운 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다.
11. 시료를 실온에서 10분 동안 배양하고, 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.
12. 상층액을 제거하고, 펠렛을 7,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 75% 에탄올 1 mL로 세척한다.
13. 에탄올이 증발 할 때까지 펠렛을 실온에서 건조시킨다.
14. RNase가 없는 물에 현탁합니다.
15. 흡수 분광 광도계를 사용하여 시료의 순도를 정량화하고 측정하며, 파장 260 nm 및 280 nm에서 측정합니다. RNA 순도를 측정하고 순도 비율(A260/280)이 약 2.0인 샘플을 사용합니다.
16. 샘플을 -80 ° C에서 보관하십시오.
17. 제조업체의 프로토콜¹⁷에 따라 RT-PCR을 수행합니다.
    참고: 연구 목표에 따라 평가할 특정 마커를 선택합니다.

8. 단백질 동정을 통한 세포 기능 평가

참고: 연구 목표에 따라 평가할 특정 단백질을 선택합니다. 예를 들어, 상아질 시알로프로테인(DSP)은 치아세포 활성 평가를 위한 관심 단백질로 제시됩니다. 관심있는 다른 단백질은 표 1에서 볼 수 있습니다.

1. 커버슬립에서 세포를 배양하고 앞에서 설명한 대로 추출물에 노출시킵니다.
2. 배양된 세포를 PBS로 세척한다.
3. 실온에서 3.7 분 동안 30 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.
4. PBS로 두 번 씻으십시오.
5. PBS에서 0.5% 트리톤으로 15분 동안 투과합니다.
6. PBS 중의 0.3% 과산화수소로 퍼옥시다아제를 5분 동안 차단한다.
7. PBS로 두 번 씻으십시오.
8. 0.5% 소혈청알부민(BSA)으로 두 번 씻습니다.
9. 45분 동안 2% BSA로 세포 배양을 차단합니다.
10. PBS에서 0.5% BSA로 세척하십시오.
11. 선별된 단백질에 따른 1차 항체와 함께 실온에서 60분 동안 배양한다.
    참고: 이 프로토콜은 1차 항체 DSP(M20) 항체(1:100)와 2차 항체 다클론 토끼 항염소 면역글로불린/HRP(1:100)를 사용합니다.
12. PBS에서 0.5% BSA로 5회 세척합니다.
13. 실온에서 90분 동안 2차 항체와 함께 배양합니다.
    참고: PBS에서 0.5% BSA를 사용하여 항체 희석액을 만드십시오.
14. 각 세척에서 1분 동안 PBS에서 0.5% BSA로 5회 세척합니다.
15. 25분 동안 20μL chromogen/mL 기질 농도의 기질 및 발색원 혼합물과 함께 배양합니다.
16. PBS에서 0.5% BSA로 두 번 세척합니다.
17. 헤마톡실린으로 15분 동안 카운터스테인을 사용합니다.
18. 0.037 mol/L 암모니아와 증류수로 5분 동안 세척하여 과잉 염료를 제거합니다.
19. 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 글리세롤을 장착 매체로 사용하십시오.
20. 밤새 말리십시오.
21. 현미경으로 보십시오. 선택한 배율로 사진을 촬영합니다.

9. Alizarin Red S assay를 통한 광물화 평가

1. Alizarin Red S 용액을 40 mM 농도로 준비한다¹⁸. 어둠 속에서 12 시간 동안 균질화를 위해 용액을 저어줍니다.
   알림: Alizarin Red S 용액 100mL를 준비하려면 빛으로부터 보호되는 초순수에 알리자린 분말 1.44g(분자량: 360g/mol)을 가용화합니다. 이 용액의 경우 pH 값은 매우 중요하며 4.1에서 4.3 사이여야 합니다.
2. 위에서 설명한 대로 가용성 추출물로 세포 배양을 배양합니다.
3. 세포 배양물을 PBS로 세 번 세척합니다.
4. 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.
5. PBS로 세 번 씻으십시오.
6. Alizarin Red Staining 용액으로 염색하여 37°C에서 20분간 암실에 두었다.
7. 염색 후, 플레이트를 PBS로 세척하여 과량의 염료를 제거한다.
8. 현미경으로 보십시오. 선택한 배율로 사진을 촬영합니다.
9. 10%(w/v) 아세트산과 20%(w/v) 메탄올로 구성된 추출 용액을 각 웰에 넣고 실온에서 40분 동안 교반합니다.
10. 분광광도계(¹⁹)로 490 nm 파장에서의 흡광도를 측정한다.

여기서 대표적인 결과는 치과 용 생체 재료 연구를 나타냅니다. 추출물 방법론을 통해 대사 활성(그림 2), 세포 생존율, 세포 사멸 프로필 및 세포 형태(그림 3), 특정 단백질 발현(그림 4)에 대한 영향과 관련하여 치과 재료에 노출한 후 세포 독성 프로필 및 세포 기능을 얻을 수 있습니다.

MTT 분석은 간단한 방법으로 물질의 세포 독성에 대한 빠른 개요를 얻는 데 사용됩니다. 두 개 이상의 재료를 비교할 수 있습니다(그림 2). 낮은 농도 (6.25 %) 및 중간 농도 (50 %)에서도 대사 활성의 심각한 감소는 더 높은 독성을 나타냅니다 (그림 2a). 동시에, 세포 독성 물질이 적을수록 더 가볍거나 전혀 감소하지 않습니다 (그림 2b). 서로 다른 시점 간의 비교를 통해 보다 즉각적인 세포독성 효과를 결정하거나 이후 단계에서 결정할 수 있습니다.

세포 생존력에 대한 영향은 생존 가능한 세포 감소에 대한 중요한 정보를 제공하며, 이는 손상 효과 후 조직의 회복 능력을 손상시킬 수 있습니다. 생존 가능한 세포의 백분율을 결정하면 물질 세포 독성을 비교할 수 있습니다. 더 많은 세포독성 물질은 동일한 농도에 대해 더 높은 세포 사멸을 유도합니다(그림 3a 및 3b). 30% 이상의 감소는 매우 중요하며 생체 적합성이 낮은 위험을 가진 물질을 정의합니다(그림 3a). 이 정보는 세포 사멸 프로파일과 함께 완성됩니다(그림 3a 및 3b). 대표적인 결과에서, 세포독성 물질이 많을수록 세포 생존율이 두드러지게 감소하고 후기 세포자멸사 및 괴사 세포 사멸 프로파일이 나타나는 반면(그림 3a), 세포독성이 적은 물질은 세포 사멸이 적고 세포사멸 및 후기 세포사멸 프로파일이 더 많이 나타납니다(그림 3b).

세포 형태학 평가(도 3c)로부터 얻어진 정보는 세포 생존율 평가를 보완한다. 세포의 전형적인 형태로부터의 변화는 세포사멸 또는 괴사를 나타낼 수 있다¹⁶. 또한 이 프로토콜에서 재료 입자 관찰과 같은 추가 정보를 얻을 수 있습니다(빨간색 화살표, 그림 3C).

추출물 노출에 의해 영향을 받는 세포 기능의 기본이 되는 특정 마커는 면역조직화학, PCR, 유세포 분석, 블로팅 또는 비색 분석과 같은 여러 기술로 평가할 수 있습니다(표 1). 추출물에 노출된 후의 DSP 발현의 대표적인 결과는 도 4a에 나타나 있으며, 일부 물질(트리칼슘 실리케이트, 시멘트)이 세포를 자극하여 단백질 발현을 증가시키는 것을 알 수 있다. 대조적으로, 다른 것들(수산화칼슘 시멘트)은 생존력 손실과 무관하게 단백질 발현의 현저한 감소를 촉진합니다. 두 경우 모두 추출물의 농도는 단백질 발현에 직접적인 영향을 미칩니다.

치아 세포 표현형의 MDPC-23 세포주에서, mineralization deposits의 형성이 특징적이다. 광물화 퇴적물 식별 및 정량화를 위한 프로토콜을 통해 이러한 유형의 특수 세포의 특정 기능을 평가할 수 있습니다. 제시된 경우, 세포 독성이 적을뿐만 아니라, 규산 삼 칼슘 시멘트가 세포 기능을 자극하는 것으로 관찰되었으며, 일단 광물 화 된 침전물의 증가가 관찰되었다 (그림 4b). 반대로, 세포 독성이 더 강한 수산화칼슘 시멘트는 세포 손상 및 사멸로 인한 미네랄 침착을 감소시켰습니다(그림 4b). 정성적 평가 외에도 정량적 측정을 수행할 수 있습니다(그림 4c).

그림 2: 대사 활동. 수산화칼슘 시멘트[a] 및 규산삼칼슘 시멘트[b)]로 처리된 MDPC-23 세포의 대사 활성은 24, 72 및 120시간 동안 용해성 추출물입니다. 결과는 100%의 값으로 대조군 세포 배양으로 정규화됩니다. 유의한 차이는 *로 표시되며, 여기서 *는 p<0.05를 의미하고, **는 p<0.01을 의미하고, ***는 p<0.001을 의미합니다. 이 도면의 일부는 출판사(²⁰)의 허가를 받아 이전 발행물로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 세포 생존율, 사멸 프로파일 및 세포 형태. 노출 120시간 후 6.25% 및 50% 농도의 수산화칼슘 및 규산삼칼슘 생체재료로 처리된 MDPC-23 세포에서 세포 생존율, 세포 사멸 프로파일 및 세포 형태. a) 및 b) 결과는 아폽토시스, 후기 아폽토시스 또는 괴사, 및 괴사에서 살아있는 세포의 백분율로 표시됩니다. 대조군과 관련하여 또는 조건들 사이의 유의한 차이는 *로 표시되며, 여기서 *는 p<0.05를 의미하고, **는 p<0.01을 의미하고, ***는 p<0.001을 의미한다. c) 50% 농도의 생체 재료 가용성 추출물로 처리한 후 May-Grünwald Giemsa로 염색한 세포. 대조군은 10% FBS를 사용하여 DMEM에서 배양된 세포를 나타냅니다. 왼쪽 열의 이미지는 100x의 배율로 얻었고 오른쪽 열의 이미지는 500x의 배율로 얻었습니다. 그림 막대는 100μm를 나타냅니다. 이 도면의 일부는 출판사(²⁰)의 허가를 받아 이전 발행물로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: DSP 발현 및 광물화된 결절 형성. a) MDPC-23 세포를 96시간 배양 후 50% 및 6.25%의 농도로 수산화칼슘 및 삼칼슘 실리케이트로 처리하였을 때 DSP 발현의 검출을 위해 면역세포화학에 의해 표지된 세포. b) 배양 120시간 후 수산화칼슘 및 규산삼칼슘 생체 재료로 처리했을 때 Alizarin Red S 염색으로 염색된 배양된 MDPC-23 세포의 이미지를 50% 및 6.25% 농도로 처리했습니다. 모든 사진은 100x의 배율로 얻어졌습니다. 두 그림 막대 모두 150μm를 나타냅니다. c) 노출 120시간 후 수산화칼슘 및 규산삼칼슘으로 처리된 MDPC-23 세포로부터 칼슘 침전물의 형성. 결과는 샘플과 대조군의 흡광도의 비율입니다. 유의한 차이는 *로 표시되며, 여기서 *는 p<0.05를 의미하고, **는 p<0.01을 의미하고, ***는 p<0.001을 의미합니다. 이 도면의 일부는 출판사(²⁰)의 허가를 받아 이전 발행물로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 치모세포 분화/기능 마커^{목록 47-79}. 이 표는 치모세포 마커 및 검출 방법 목록을 제공합니다. 이러한 마커 중 일부는 다른 조직에서도 발현됩니다.

이 프로토콜은 조직과 접촉하는 생체 재료의 시험관 내 세포 독성 평가를 지칭하는 ISO 10993-5를 고려하여 설계되었으며, 생체 적합성을 평가하고 연구 재현성에 기여합니다²¹. 이것은 과학에서 점점 더 많은 관심사이며, 많은 저자들은 이미 시험관 내 연구 15,22,23,24,25,26,27,28의 실험 설계에서 이러한 권장 사항을 따르고 있습니다.

제안된 방법론은 세포 생물학의 가장 관련성이 높은 측면을 선별하기 위해 선택되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 표현형에서 기능에 이르는 여러 세포 매개변수를 포함하여 일반적인 분석 및 보완 평가를 사용하여 세포 독성을 평가하는 완전한 접근 방식을 제공하면 권장 사항을 뛰어넘습니다. 이 보완 평가는 생존력이 유전자 및 단백질 발현, 세포주기 또는 세크레톰 수준에서 변화를 번역하지 않을 수 있는 경우 생체 재료 효과를 진정으로 평가하는 데 중요합니다.

추출물은 특히 부착성 세포주에서 유리한데, 그 이유는 물질이 배양 플레이트^22,28의 표면 상에 배치되는 일부 직접 접촉 접근법에 반대되는 기질 및 최적 배양 조건에 대한 세포 부착에 간섭이 없기 때문이다.

더욱이, 추출물은 세포가 상이한 농도에 노출될 수 있게 하여(²⁹), 조직 내 물질의 확산을 모방하여, 특히 극도로 관개된 조직과 접촉하여 적용될 때 생체 내에서 발생하는 제거를 시뮬레이션한다. 직접 접촉 검사는 다른 농도를 정확하게 평가하지 못할 수 있으며 간접 접촉 검사는 비 확산, 막을 통한 불완전 확산 또는 한천과의 반응에 잠재적 인 어려움을 보여주었습니다.

정량적 평가를 제공하는 시험이 선호되며, 세포 생존율이 30% 이상 감소하는 것이 세포독성으로 간주된다^11,30. 새로운 생체 재료의 개발에 있어서, 이러한 감소가 발생하면, 재형성 또는 포기의 필요성이 결정된다. 고무적인 결과가 달성되면 생체 내 평가^29,31을 구상하는 추가 연구가 수행되어야 합니다.

시험관 내 테스트는 임상 상태를 시뮬레이션하거나 과장해야 합니다. 따라서 추출물 제조를 위한 적절한 표면 부피 비율을 결정하는 것이 중요합니다. 1.25-6 cm²/mL의 표면 대 부피 비율이 제안되었습니다. 폼과 같이 표면이 요철이 있는 재료의 경우 0.1–0.2g/mL 또는^6cm2/mL가 시작점입니다 15,20,2. 배지 mL 당 250^mm2의 비율이 이 프로토콜 및 기타 연구에서 사용된 대표적인 결과인^15,20을 사용하였다.

클리닉에서 이러한 방식으로 사용하지 않더라도 샘플은 특성을 변경하지 않는 방법으로 멸균해야합니다. UV 조사는 종종 좋은 선택입니다. 이는 세포 배양물의 미생물 오염을 방지하는 데 가장 중요하다 11,24,32.

추출 배지는 혈청, 생리식염수, 디메틸술폭시드, 또는 정제수를 포함하거나 포함하지 않는 세포 배양 배지를 포함하며, 생체 재료의 화학적 특성에 따라 선택된다^11,33. 세포 배양 연구를 목표로, 세포 배양 배지의 사용은 추가의 처리 단계를 회피하기 때문에 바람직하다. 추출 조건은 실험 모델에 맞게 조정되어야 합니다. 이러한 프로토콜에 나타낸 대표적인 결과에서, FBS로 보충된 DMEM 배양 배지는 37 ± 1°C에서 24 ± 2시간 동안 사용되었다.

일부 생체 재료는 추출 배지에 잔류물을 남길 수 있으며, 이는 세포 배양에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 여과 및 원심분리는 피해야 하지만 사용하기 전에 입자가 침전되도록 할 수 있습니다. 또 다른 문제는 추출 후 변할 수 있는 pH입니다. 추가 조정⁽¹¹)을 수행하는 것은 권장되지 않기 때문에, 추출물의 pH를 측정하고, 등록해야 하며, 필요한 경우 pH 효과를 분리하기 위한 추가 대조군을 실험 설계에 포함시켜야 한다.

이 프로토콜은 부착 세포 배양에 대해 설명되었지만 현탁 배양을 사용하기 위해 간단한 변형을 수행할 수 있습니다. 유사하게, 고체 생체 재료를 사용하는 것 외에, 액체, 겔 또는 발포체를 연구하기 위해 절차, 본질적으로 추출 단계를 적응시킬 수 있다^34,35,36,37.

적절한 밀도의 세포 배양을 준비하는 것은 특히 복제율이 높은 세포 배양에서 매우 중요하다³¹. 사용된 세포의 권장 파종 밀도 범위에 따라 장기간 배양을 계획하는 경우 과도한 합류와 관련된 문제를 피하기 위해 초기 파종 밀도를 줄여야 합니다. 또한, 세포 독성이 높은 물질은 더 높은 초기 파종 밀도를 필요로 할 수 있습니다.

추출 방법론의 장점 외에도 세포 부착 평가와 관련된 재료에 대한 최선의 선택은 아닙니다. 이 경우 직접 접촉 연구는 38,39,40,41을 수행해야합니다. 이것은 포괄적인 접근법이지만, 생체 내 조건을 완전히 반영하지 않는 시험관 내 평가라는 점을 명심하는 것이 중요하다⁴².

생체 재료는 조직에 손상을 줄뿐만 아니라 항 염증 및 면역 조절 과정^(43,44,45,46)을 자극해야합니다. 따라서 이 프로토콜은 세포 생존율 및 세포 사멸 프로필을 포함한 세포 메커니즘과 단백질 합성의 다른 메커니즘의 평가와 함께 더 나아갑니다. 수행 된 평가는 세포 독성 외에도 생체 조직의 생체 재료 생체 활성에 대한 결론을 내릴 수 있어야합니다.

치과뿐만 아니라 정형외과, 외과, 안과, 심장학 등 의료용 신소재가 폭발적으로 증가함에 따라 초기 검진은 체계적으로 이루어져야 합니다. 이 프로토콜은 새로운 생체 재료를 개발하고 특성화하는 것을 목표로 하는 연구자에게 중요한 도구가 될 수 있습니다.

저자는 경쟁적인 재정적 이해 관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

We thank the following for support: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB는 전략 프로젝트 UIDB/04539/2020 및 UIDP/04539/2020(CIBB)을 통해 FCT(Foundation for Science and Technology)를 통해 국가 기금으로 자금을 지원받습니다. MDPC-23 세포주를 제공한 University of Michigan Dental School의 Jacques Nör에게 감사드립니다.