이 콘텐츠 이미징 분석 Rhodopsin 전송 분석 결과

여기, 우리는 계량의 rhodopsin 돌연변이 망막 화와 관련 된 전송 하는 콘텐츠 이미징 방법을 설명 합니다. 다중 파장 득점 분석 rhodopsin 단백질 세포 표면에 또는 전체 셀에서 계량에 사용 되었다.

Rhodopsin misfolding 돌연변이 상 염색체 지배적인 망막 화 (RP), 효과적인 치료 부족 질병 눈부신 진보로 각 성 하는 로드 포토 리셉터 죽음으로 이어질. 우리가 가설을 misfolded rhodopsin 돌연변이의 세포 독성 약리학 돌연변이 rhodopsin 단백질 안정화에 의해 완화 될 수 있다. P23H 돌연변이 다른 클래스 II rhodopsin 변이 중 인코딩합니다 구조적으로 불안정 rhodopsin 돌연변이 단백질을 바인딩과 그물 (ER)에 누적 된 반면 야생 타입 rhodopsin 포유류에 플라즈마 막에 수송 된다 셀입니다. 우리는 이전 발광 기반 높은 처리량 화면 (HTS)을 수행 하 고 응급실에서 원형질 막의 P23H rhodopsin의 전송 구조 약리 보호자의 그룹을 식별. 돌연변이 rhodopsin 단백질 금액과 전체 세포에서 원형질 막에는 여기, 정량이 콘텐츠 이미징 분석 다음 immunostaining 메서드를 사용 하 여, 우리. 이 메서드는 유익 하 고 가양성 HTS. 다음에서 진정한 안타를 식별 하는 효과적인 또한,이 콘텐츠 이미지 분석 계량 각 화합물의 약리 속성을 평가 하는 하나의 실험에서 여러 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 6 RP 관련 rhodopsin 돌연변이, 이러한 rhodopsin 돌연변이의 구조적 안정성에 대 한 양적 및 질적 이해에 대 한 2 차원 약리 프로필을 얻는 쪽으로 11 다른 화합물의 효과 분석 그리고 이러한 돌연변이 향해 다른 화합물의 효능입니다.

단백질 misfolding은 근이 영양 증, 신경 유년으로 망막 화 (RP)¹를 포함 하 여 눈부신 질병에 관여. RP 상속 및 진보적인 망막 변성 기능과 항상성 막대 대뇌 또는 망막 안료 epitheliums (RPEs)^2,3에 영향을 미치는 60 개 이상의 유전자에 돌연변이와 관련 된입니다. 효과적인 치료는 현재 RP에 대 한 합니다. Rhodopsin 돌연변이 RP의 경우 상 염색체 지배 (광고)의 약 25-30%를 위한 계정. 150 이상 rhodopsin 돌연변이⁴ (인간의 유전자 돌연변이 데이터베이스, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), 중 클래스 II 돌연변이 로드 포토 리셉터 죽음에 기여 rhodopsin 단백질의 구조적 불안정의 원인이 고 시력 손실^5,6,,78. P23H 이다 북아메리카에 있는 가장 빈번한 rhodopsin 돌연변이 또한 클래스 II rhodopsin 돌연변이^9,10의 전형적인 예. 그것의 고유한 구조 불안정으로 인해 misfolded rhodopsin는 야생 타입 rhodopsin 원형질 막⁵에 위치 하 고 있습니다 반면 포유류 세포에서 바인딩과 그물 (ER)에 축적 됩니다. Misfolded rhodopsin P23H 돌연변이 전시 지배적인 부정적인 세포 독성 haploinsufficiency, 때문만 아니다 하지만 응급실의 활성화로 관련 단백질 강 직 통로 중단된 막대 외부 세그먼트 조직 관련. 로드 포토 리셉터 세포 스트레스 완화, 한 전략 약리 보호자를 사용 하 여 돌연변이 rhodopsin의 네이티브 접는 안정화 하는.

이 위해 우리는 높은 처리량 화면 셀 기반 (HTSs)^11,12,13 P23H rhodopsin 돌연변이 플라즈마에 이송 계량 하는 β-galactosidase 조각 보완성 분석 결과 사용 하 여 수행 막입니다. 이 HTS 분석 결과의 강력 하 고 간단한 프로토콜 우리 각 화면에 대 한 정도 79000 작은 분자의 활동을 탐구를 활성화. 그러나,이 HTS 분석 결과 발광 신호 읽기, 때문에 가양성 β-gal 억제제를 포함 하 여 색 또는 세포 독성 화합물 포함 되며 2 차 분석 결과 의해 식별 대기 히트 목록에.

전통적인 immunostaining 및 형광 이미징 방법 포유류 세포^5,14,,1516의 rhodopsin 교통 공부를 몇 년 동안 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 기존의 방법 신뢰할 수 있는 이미징 분석은 높게 일관 된 조건 하에서 촬영 한 이미지의 많은 수를 요구 하기 때문에 rhodopsin 전송으로 10 개 이상 화합물의 약리 효과 척도를 사용할 수 없습니다. 기존의 이미징 방법으로 하지 amendable. 여기, 우리 misfolded rhodopsin 돌연변이^11,,1317의 셀 표면 수송 척도를 2 차 분석 결과 기반으로 하는 immunostaining이 콘텐츠 이미징 프로토콜 개발. 원형질 막에 rhodopsin 레이블을, 우리 생략 세포 막 permeabilization와 immunostained의 단계 rhodopsin 돌연변이 단일 클로 널 (b 6-30) 안티 rhodopsin 셀의 extracellular 측에 rhodopsin의 N 맨끝 epitope를 인식 하 여 막¹⁸. 전체 셀에 돌연변이 rhodopsin를 시각화 하려면 우리 rhodopsin 금성 형광 단백질을 융합. 다른 형광 채널에 형광 강렬의 정량화, 총 rhodopsin 강도 포함 하 여 전체 셀, 셀 표면에의 비율에에서 1 개의 단 하나 실험에서 여러 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 세포 표면에는 전체 셀에서의 rhodopsin 형광 안정적인 6 misfolded rhodopsin 뮤턴트의 총을 표현 하는 세포에이 방법을 적용, 우리이 뮤턴트 쪽으로 여러 개의 작은 분자 보호자의 약리 프로 파일을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 모든 셀 immunostained 384-잘 접시에 있으며 매우 일관 된 이미징 조건 하에서 자동된 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데. 이미지 분석은 600 개 이상의 셀을 셀 모양 및 단백질 표정 수준 변화와 셀의는 인해 변화를 줄이기 위해의 이미지가 포함 된 각 잘 수행 됩니다. 이 프로토콜의 워크플로 그림 1에 요약 됩니다. 이 방법의 장점은 우리 이미지 기반 분석에서 고해상도 이미지 뿐만 아니라 다중 매개 변수 quantifications를 얻을입니다. 일반적으로,이 프로토콜 수정 하 고 계량 관심사의 어떤 misfolded 막 단백질의 수송에 적용 될 수 있습니다.

참고: rhodopsin 전송 시험.

1. 준비 및 세포의 문화

1. 부활 cryo 보존 U2OS 안정 세포는 야생 타입 (WT) 또는 돌연변이 마우스 rhodopsin 금성 융해 단백질을 표현. 만 작은 얼음 결정은 유리병에 남아 때까지 37 ° C에서 세포를 녹여.
   참고: U2OS 셀 사용 됩니다이 프로토콜에 있기 때문에 포토 리셉터 셀 라인 생체 외에서 연구에 사용할 수 있는 미리 속눈썹 생 합성 rhodopsin의 포유류 세포에 있는 유사한 분자 메커니즘에 의해 규제 됩니다. 또한, U2OS 셀 접시의 바닥에 단단히 부착 있고 큰 세포 기관, 그래서 그들은 rhodopsin 전송 분석 결과 대 한 이상적입니다. 7 U2OS 안정 세포 표현 WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이 사용 품질 및 신뢰성 분석 결과의 표시 예를 들어 여기. 분석 결과의 목표에 따라 볼 수 있듯이 다른 rhodopsin 돌연변이 또는 다른 막 단백질을 표현 하는 안정 된 세포를 사용할 수 있습니다. 안정적인 세포 인간의 rhodopsin 표현 가능한 경우이 분석 결과에 사용할 수 있습니다. 때문에 95% 상 동을 공유 하는 마우스 및 인간의 rhodopsin 단백질 화합물이 분석이 결과 의해 확인 된 것 이며 테스트 비보에 rhodopsin P23H 돌연변이⁸을 들고 마우스 adRP 모델을 사용 하 여 마우스 rhodopsin는 여기 사용 되었다. 안정적인 셀¹⁹위에서 설명한 대로 생성 되었다. WT 및 돌연변이 rhodopsin 성적 질문-PCR에 의해 계량 했다 그리고 WT과 돌연변이 rhodopsin 녹취 록의 표현 하는 안정적인 세포의 클론이 분석이 결과 대 한 선정 됐다. Rhodopsin 단백질의 표현은 immunoblot와 immunostaining에 의해 확인 되었다. 이 분석 결과에서 사용 하는 셀의 통로 20 보다 낮은 되어야 합니다.
2. (높은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글의 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 매체 (DMEM)과 5 µ g/mL Plasmocin) 성장 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브로 셀의 각 줄을 전송 합니다.
3. 원심 200 x g 5 분 삭제에 튜브는 상쾌한 고 각 셀 라인에 대 한 세포 성장 매체의 5 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend. 60 m m 조직 문화 접시에 셀 서 스 펜 션의 각 줄을 전송 하 고 5% CO₂와 37 ° C에서 품 어.
4. 하위 조직 문화 접시로 90%의 합류를 도달할 때 셀 참조¹²에 설명 된.

2. 시드 잘 당 5000 셀에 셀

참고: 조직 문화 후드에서 다음 절차를 수행 합니다.

1. 폴 리-리와 플레이트를 취급 합니다.
   1. 셀을 뿌리기 전에 1 일 치료 블랙 벽 고 20 µ L/잘 30 분 폴 리 리 신 솔루션의 바닥판 384-잘 취소 합니다.
   2. 액체를 발음 하 고 모든 우물 1 h. 넣어 다시 접시 뚜껑에 대 한 건조 허용 4 ° C에서 하룻밤 셀 시드 접시를 저장.
2. 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
   1. 90% 합류까지 100mm 조직 배양 접시에 성장 매체에서 각 셀 라인 문화.
   2. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 각 접시를 세척 하 고 0.05%의 1 mL로 세포 분리 37 ° c.에 트립 신
   3. 분석 결과 매체 (10 %FBS, 100 단위/mL 페니실린 및 100 μ g/mL 스 높은 포도 당 DMEM) 10 mL에 셀의 각 라인 resuspend
   4. 셀을 계산 하 고 분석 결과 매체와 10⁵ 셀/mL x 1.25 셀의 각 줄을 희석.
3. 씨 셀입니다.
   1. 전자 멀티 채널 피 펫 또는 자동화 된 시 약 디스펜서를 사용 하 여 셀 선 및 채우기 열 1-21 (그림 2) 384-잘 접시의 당 세 개의 열에 세포 현 탁 액의 40 µ L/잘 분배 하.
   2. U2OS의 40 µ L/잘 추가 (P23H-Rhodopsin-금성) 열 22-23을 U2OS의 40 µ L/잘 (Rhodopsin-금성) 열 컨트롤로 24.
   3. 300 x g 30에서 격판덮개 원심 384-잘 접시의 바닥에 모든 셀을 내리게 하기 위해 s.
      참고: 셀 시드 후 접시에 물리적 충격을 피하십시오. 그렇지 않으면, 셀의 각, 한 모서리에 짓 눌린 것입니다 하 고 접시가 콘텐츠 이미징에 대 한 적합 하지 않을 것 이다.
   4. 5% CO₂ 접시의 하단에 연결할 셀 3 h 37 ° C에서 384-잘 접시를 품 어.

3. 치료 화합물과 셀

1. 그림 2와 같이 치료 조건 판 지도 생성 합니다.
2. 작업 솔루션 96 잘 접시에 최대 15 화합물의 x 5의 300 µ L를 준비 합니다.
   1. 5 번 96-우물의 우물 A1 g 2에 있는 그들의 마지막 농도의 접시 (그림 2A)을 분석 결과 매체와 cps 1 ~ 15을 희석. 잘 h 2에서 분석 결과 매체의 300 µ L를 추가 합니다.
      참고: 각 화합물의 최종 농도 사용 됩니다 가장 효과적인 농도에 P23H rhodopsin의 전송 구조 HTS^12,13.
   2. 2% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 당 100 µ L를 추가 25 µ m 9-시스-망막 열 11, 12, 분석 결과 중간에 각각 희석 하는. 추가 9-cis-희미 한 빛에 망막.
3. 384 잘 플레이트 세포 (그림 2B)와 교양에 대 한 솔루션을 작동 하는 x 5의 당 10 µ L를 추가 합니다.
   1. 전자 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 열 1 ~ 21 (그림 2)에서 화합물 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15 행 A, C, E, G, I, K, M, 및 O를 추가. 화합물을 추가 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 열 1 ~ 21에서에서 행 B, D, F, H, J, L, N 및 P M.
   2. 열 22 및 24 2 %DMSO 당 10 µ L를 추가 합니다. 9-25 µ M의 당 10 µ L 추가시스-망막 열 23.
      참고: DMSO는 사용 차량 제어로 모든 화합물 처음 주식으로 DMSO에 용 해 하기 때문에. 22 DMSO 치료 세포를 포함 하는 P23H 표현 rhodopsin 사용 됩니다 0% 제어 하는 열입니다. 9-시스-망막 치료 세포 P23H rhodopsin 표현 100% 컨트롤으로 사용 됩니다.
4. 알루미늄 호 일 384-잘 접시를 커버 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.

4. 세포 표면에 Rhodopsin 단백질 얼룩 막 Permeabilization 없이 Immunostaining.

참고: 어떤 세제를를 지키고 세포 막 전체 immunostaining 과정에서 피하십시오.

1. 16%를 diluting 하 여 4 %paraformaldehyde (PFA) 준비 PFA 화학 증기 두건에서 1:4 볼륨 비율에 PBS 가진. 전송 4 %PFA 시 저수지에서.
2. 희미 한 붉은 빛으로 어두운 방에 384-잘 접시를 꺼내. 진공 수집 병에 연결 하는 8 채널 흡 인기를 사용 하 여 매체를 부드럽게 발음. 갓된 4%의 당 20 µ L을 추가 하는 전자 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 전체 384-잘 접시에는 PFA 및 실 온에서 20 분 동안 품 어. 세포 분리를 방지 하려면 항상 포인트는 흡 인기의 끝 각의 같은 쪽에 열망 하는 동안. 각의 중앙 하단 영역을 만지지 마십시오. 이미지를 복용 했을 때 지역에 흡 인기에 의해 감동 하지 않으려면 필드를 선택 합니다. 10 분 이상 외피, 384-잘 접시 증발을 방지 하는 뚜껑으로 커버.
   참고: 셀을 100% 제어의 결과 영향을 미칠 것입니다 재생된 isorhodopsin의 photobleaching을 피하기 위해 어두운 방에 고정 됩니다. 고정, 후 정상적인 빛에서 384-잘 접시 밖으로 촬영 수 있습니다.
3. 각 잘에서 PFA 발음 전자 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 PBS의 당 50 μ를 추가 하는 8 채널 흡 인기를 사용 합니다. PBS 가진 3 개의 세척을 수행을 두 번 더 반복 합니다.
   주의: 폐기물 액체 포함 PFA 출장된 병에 수집 하 고 실험 후 유해 화학 낭비로 처분 될 것 이다.
4. 전체 384-잘 접시에 5% 염소 혈 청의 당 20 µ L을 추가 하 여 셀을 차단 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
5. 5% 염소 혈 청을 발음 하 고 추가 15 µ L 당 20 µ g mL^-1 b 6-30 안티 rhodopsin 항 체의 1% 염소 혈 청에서 2 차 항 체 전용 컨트롤 그룹에 대 한 행 P 1% 염소 혈 청의 잘 당 오 추가 15 µ L A 행.
6. 90 분 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 384-잘 접시를 밤새 품 어. 커버 알루미늄 호 일을 피하기 위해 photobleaching는 fluorophores의 384-잘 접시.
7. PBS의 당 50 µ L로 3 회 접시를 씻어.
8. PBS를 발음 하 고 5 µ g mL^-1 Cy3 활용 된 염소 반대로 마우스 IgG 항 체의 당 15 µ L를 추가 합니다. 알루미늄 호 일 384-잘 접시를 커버 하 고 1 시간을 위한 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.
9. PBS의 당 50 µ L로 3 회 접시를 씻어. 1 µ g mL^-1 15 분 동안 실 온에서 핵 얼룩 Hoechst 33342 포함 된 PBS의 당 50 µ L를 추가 합니다.
10. 이미징 하기 전에 투명 한 필름으로 384-잘 접시를 봉인. 커버 알루미늄 호 일로 384-잘 접시와 이미지 즉시 이동 하는 경우 1 주까지 4 ° C에서 저장 합니다.

5입니다. 영상_입니다.

참고:이 콘텐츠 이미징 절차는 자료의 테이블에에서 나열 된 이미징 시스템에 적응. 절차는 다른 높은 콘텐츠 이미징 시스템을 사용 하는 경우 달라질 수 있습니다.

1. 뚜껑을 제거 하 고 a 1 접시의 왼쪽된 상단 모서리에 배치와 함께 콘텐츠 영상에 384-잘 접시를 넣어.
2. 이미지 수집에 대 한 매개 변수를 설정 하는 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다.
   1. 새로운 설정 판 수집 설정 창을 열고 만들거나 기존 설치 파일을 로드 합니다.
   2. 20 x 목표를 선택 하 고 픽셀 보정된 픽셀 크기는 0.80 x 0.80 그래서 2로 binning 설정 µ m.을 설정 스캔 라인 2000와 이미지 크기 (W x H) 사이트 당 1000 x 1000 픽셀 (800.00 µ m x 800.00).
   3. 몇 군데 수 접시 유형을 선택 합니다. 384 잘 플레이트의 제조업체에서 제공 하는 정보를 사용 하 여 접시 크기에 맞게.
   4. 웰 스는 384-잘 접시에 대 한 이미지를 선택 합니다.
   5. 잘 당 이미지를 4 개의 사이트를 선택 합니다. 잘 감동 포부 팁의 측면을 하지 마십시오.
   6. 405, 여기 레이저 선택 및 561 488 nm. DAPI, FITC, 텍사스 레드 채널에 대 한 배출 필터를 선택 합니다. 레이저 파워를 최적화 하 고 긍정적인 통제 우물에서 촬영 한 이미지의 밝기를 보장 하기 위해 각 채널의 이득을 채도 임계값 보다는.
   7. 자동 초점에 대 한 잘-투-잘 초점을 선택 합니다. 첫 번째 잘 잘 샘플을 찾기 위한 초기도 인수를 선택 합니다. 모든 사이트에 사이트 자동 초점을 설정 합니다.
   8. 각 채널에 대 한 줄당 4 개의 평균을 선택 합니다. 각 채널에 대 한 Z-오프셋 값을 최적화 합니다.
   9. 되도록 이미지 384 잘 플레이트의 대각선 모서리에 2-3 웰 스는 초점에 모든 테스트 웰 스, 잘 당 모든 사이트에서 이미지는 셀 이상의 40% 합류, 그리고 모든 채널의 형광 강도 약 절반 포화 100% 테스트 웰 스를 제어 합니다.
   10. 이미지 수집 방법을 저장 합니다.
3. 전체 접시를 실행 합니다. 시계는 영상 캡처 이미지는 영상 떠나기 전에 이미지 품질을 확인 하는 접시의 첫 번째 열에서 완료 될 때까지. 384-잘 접시를 꺼내 고 나중에 사용할 4 ° C에서 저장 합니다.
   참고: 잘 찍은 채널 당 선택 하는 사이트의 수에 따라 걸립니다 40 분 한 384-잘 접시 이미징 완료 3 h.

6. 이미지 분석입니다.

1. 이 콘텐츠 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터를 당겨. 매개 변수를 설정 하려면 100% 제어 웰 스 (23 열) 중 하나를 선택 합니다.
2. 분석 방법으로 다중 파장 셀 점수 를 선택 하 고 시작 설정 구성.
   1. DAPI 채널에서 이미지를 사용 하 여 핵을 정의 합니다. 선택 된 정의 핵 모양 잘 핵 이미지와 잘 맞는 다는 것을 확인 하는 미리 보기.
   2. FITC 채널 rhodopsin 금성 몇 군데에서 셀의 모양을 정의 합니다.
   3. 텍사스 레드 채널에 rhodopsin 셀 표면 얼룩 영역을 정의 합니다.
   4. 설정을 최적화 된 경우 확인 하려면 5 우물에 현재 알고리즘을 테스트 합니다. 설정을 저장 하 고 구성 창을 닫습니다.
3. 최적화 된 분석 방법으로 모든 웰 스를 실행 합니다.
4. 그대로 휴대폰 번호로 개체 수 를 내보냅니다. FITC 채널의 평균 강도 Rhodopsin 금성 강도 (Rhodopsin 금성 INT)로 내보냅니다. 세포 표면 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 rhodopsin 강도로 텍사스 Red 채널의 평균 강도 내보냅니다.
5. 스프레드시트 소프트웨어에서 내보낸된 데이터를 엽니다. MEM-총 비율으로 세포 표면에 rhodopsin 강도를 rhodopsin 금성 INT에 의해 나눕니다. Z를 계산 '-분석 결과 품질을 평가 하는 각 매개 변수에 대 한 요소. Z′ = 1−3X (STD₊을_{100% 제어}표준_{0% 제어}) / | _{100% 제어}−Mean_{0% 제어}의미 |.
   참고: Z'-요소 0 나타냅니다이 콘텐츠 스크린과 Z에 대 한 충분 한 중간 분석 결과 보다 높은 ' 비율이 0.5와 1 사이 높은 처리량 화면^20,21에 필요한 뛰어난 분석 결과 나왔다.
6. 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 각 매개 변수에 대해 두 색 열 맵을 생성 하. 셀 라인 x 축과 y 축에 화합물의 이름을 정렬 합니다.

우리는 매개 변수가 세 rhodopsin 전송 특징: 전체 (Rhodopsin 금성 INT) 원형질 막 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 rhodopsin의 immunostaining 강도 및 셀의 비율의 rhodopsin 금성 강도 전체 셀 (MEM-총 비율)에 있는 rhodopsin 금성 강도를 세포 표면에 rhodopsin 얼룩. Rhodopsin 전송 분석 결과의 대표적인 결과 그림 3 과 그림 4에 표시 됩니다. DMSO와 9-를 사용 하 여cis-망막 치료 세포 각각 0과 100% 컨트롤 P23H rhodopsin 비너스를 표현 Z'-이 세 개의 매개 변수는 0 0.5, 그 분석 결과 적당 한 품질, 제안 사이의 범위에 대 한 요인 이 콘텐츠 이미징²¹에 대 한 충분 한. 도 최적화 된 Z'-요인 분석 결과 HTS에 비해 그 상대적으로 복잡 한 절차 때문에 0.5 보다 낮은,이 분석 결과 여전히 강력 하 고 안정적인 이미지 기반 분석에 대 한. 구출 misfolded rhodopsin 활성 화합물 세포 표면에 P 값이 0.05 보다 낮은 DMSO 보다 메모리 총 비율 Rhodopsin INT의 높은 값을 표시 해야 합니다. 3 2 차원 열 지도 평균 rhodopsin 금액 및 지역화 셀 (그림 4) 당 비교 하이 세 개의 매개 변수에서 생성 되었습니다. Triplicates에서 반복, WT 및 6 rhodopsin 돌연변이 가로로 나열 됩니다 그리고 복합 치료의 효과 수직으로 비교 됩니다. 이전 연구와는 rhodopsin 세포 표면에의 MEM 총 비율 INT WT rhodopsin DMSO (그림 4C)^5,,2223로 치료에 비해 6 돌연변이 대 한 낮은 있습니다. 세포 표면에 그 메모리 총 비율 rhodopsin INT 9-증가cis-망막 치료는 T4R, P23H, D190N 및 P267L, 하지만 하지 P53R 또는 C110Y 돌연변이, 그 제안에 대 한 9-cis-망막을 구출 하는 T4R의 전송 P23H, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이 모든 cps T4R, P23H 및 D190N에 대 한 세포 표면에 Rhodopsin INT에 다양 한 수준의 증가 보였다. 3, 4, 5, 7, 8 및 11 cps rhodopsin 금성 INT만 하지 이러한 화합물만 rhodopsin 금액 증가 제안 이러한 rhodopsin 돌연변이의 MEM 총 비율 증가. Cps 1, 2 6과 9는 크게 이러한 화합물 원형질 막에 이러한 rhodopsin 돌연변이의 전송 구조를 제안 하는 T4R, P23H, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이의 MEM 총 비율 증가. 2 차원 프로필 rhodopsin 전송 다른 약물 치료에 의해 완화이 adRP 관련 된 돌연변이 의해 영향을의 포괄적인 개요를 제공 합니다.

그림 1: rhodopsin 전송 분석 결과의 워크플로. 세포 표면 막 rhodopsin 전송 분석 결과 대 한 permeabilization 없이 rhodopsin의 얼룩에 대 한 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 작업 솔루션 및 384-잘 접시에 96 잘 접시에서 액체 전송 x 5의 준비에 대 한 그림. (작업 솔루션 x 5의 A)는 96 잘 접시 레이아웃. 웰 스 a 1 g 2 열 1과 2에서에서 볼 수 있듯이 작업 솔루션 및 분석 결과 중간 (M) x 15 5 최대의 당 300 µ L를 있다. 화합물 14와 15는 2 %DMSO 25 µ M 9-시스-망막, 각각, WT와 돌연변이 rhodopsin 7 셀 라인에 치료에 대 한. 또한, 열 11, 12 2 %DMSO 25 µ M 9-의 당 100 µ L를가지고cis-망막 제어, 각각, Z의 계산에 대 한 P23H rhodopsin 표현 하는 세포 치료 '-요인. (B) 384-잘 플레이트 세포 유형 및 치료 조건에 대 한 레이아웃입니다. U2OS 셀 표현 WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N 및 P267L rhodopsin 금성 같이 시드는. 치료 조건 파란색으로 표시 되어 있습니다. 핑크와 파란색 팁 384 플레이트 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시에서 잘 잘 액체 전송을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 대표 이미지와 rhodopsin 전송 분석 결과의 컨트롤에 대 한 quantifications. (A) 금성 형광 (녹색)와 WT 또는 P23H rhodopsin 비너스를 표현 하는 U2OS 세포의 세포 표면 immunostaining (레드) 처리 DMSO 또는 5 µ M 9-시스-망막. 눈금 막대 = 200 µ m. (B) A 열 작의 rhodopsin 금액 (Rhodopsin 금성 INT) 모든 셀에서을 나타내는 셀 당 평균 금성 강도. p< 0.0001. Z'-팩터 검은 선 아래 표시 됩니다. 열 값과 오차 막대는 각각 평균 및 표준 편차 (사 우 스 다코타) 16 복제입니다. (C) A 열 음모의 세포 표면 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 얼룩진 rhodopsin 나타내는 셀 당 Cy3 강도 의미. (D) 열은 그것의 전체 셀 수준 (MEM 총 비율)를 세포 표면에 rhodopsin 레벨의 비율을 나타내는 셀 당 금성 강도 의미 한 셀당 평균 cy3 강도의 비율의 줄거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 2 색으로 열 지도 표시 rhodopsin 전송 분석 결과의 대표적인 하이 콘텐츠 분석. (A)의 열 지도 전체 셀 rhodopsin 수준 (Rhodopsin 금성 INT)를 대표 하는 셀당 금성 강도 의미 한다. 각 블록 데이터 포인트를 나타냅니다 그리고 각 조건 3 중에서 테스트 되었습니다. 색 범례는 왼쪽에 표시 됩니다. Cp, 복합입니다. (B)의 열 지도 셀 표면 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 얼룩진 rhodopsin 나타내는 셀 당 Cy3 강도 의미 한다. (말은 그것의 전체 셀 수준 (MEM 총 비율)를 세포 표면에 rhodopsin 레벨의 비율을 나타내는 셀 당 금성 강도 셀당 Cy3 강도 의미의 C) 열 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

여기, 우리는 콘텐츠 이미징 분석 결과 조회 수는 HTS.에서 확인 대상이 사용 보였다 이러한 프로토콜에 관련 된 유일한 자동화 높은 콘텐츠 영상입니다. Immunostaining와 형광 이미징 rhodopsin의 rhodopsin^5,14,,1516의 지역화 특성을 일반적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 전통적인 이미징 방법으로 촬영 한 이미지의 정량화는 충분 한 셀 이미지 조건, 실험, 당 이미지의 낮은 용량 및 품질 제어 매개 변수의 부족의 부족에 의해 제한 됩니다. 우리 384-잘 형식 전통적인 immunostaining 프로토콜을 적응 하 고이 콘텐츠 이미징 전통적인 영상 교체. 이 높은 콘텐츠 이미징 프로토콜을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 선택 하 고 구분 HTS^11,,1317안타의 활동을 특징. 전통적인 immunostaining 및 이미징 방법에 비해,이 프로토콜 크게 이미징 조건, 이미지 용량 및 양적 약리 효과 비교할 수 있게 이미지 분석 힘의 농도 증가 6 adRP의 전송으로 11 화합물의 rhodopsin 돌연변이 관련.

이전에 사용 된 프로토콜에 비해 rhodopsin immunostaining 및 이미징이이 프로토콜의 주요 변화: 분명 하단 384-잘 접시;의 성장 및 immunostaining 세포를 (1) (2) 이미징이 콘텐츠 영상;를 사용 하 여 셀 그리고이 콘텐츠 이미지 분석 소프트웨어와 함께 (3) 분석 데이터. 이러한 변화는 초기 최적화는 최고의 셀 시드 수, 항 체 농도, 이미징 조건 및 이미지 분석 알고리즘을 찾을 필요 합니다.

프로토콜의 중요 한 단계를 포함: (1) 고정; 전에 50-70% 합류를 허용 하는 셀을 시드 (2) 주의 열망을 피하기 위해 셀 분리; (2) 이미지 초점에 있는지 확인 하 여 모든 채널의 형광 전체 접시에 걸쳐 여러 우물 이미징 초과 하지 않는 긍정적인 제어 웰 스에 대 한 영상의 임계값의 절반 전체 접시; 이미징 하기 전에 (3) 유지 Z'-요인 분석 결과의 신뢰성을 보장 하기 위해 0 보다 더 높은.

이 프로토콜에 대 한 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제는 세포 분리 및 낮은 Z'-요인. 첫 번째 문제를 방지 하려면 폴 리-L-리 신 셀 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 Hek293 세포 등 쉽게 분리 셀 라인을 사용 하지 마십시오와 384-잘 접시를 pretreat. 또한, 제한 포부 팁을 열망 하는 동안 각의 한 쪽을 터치 하 고 이미징에 대 한 각의 다른 측면을 선택 합니다. Z 개선 하기 '-요소와 셀 셀 모양 또는 소프트웨어에 의해 정의 된 핵 모양을 각 형광 채널에 있는 각 개체와 잘 맞는 있는지 확인 수 및 이미지 분석 매개 변수를 뿌리기 최적화 분석 결과 품질.

이 콘텐츠 이미징 방법 단정 rhodopsin 전송, 세포 표면 ELISA 또는 β-galactosidase 조각 보완성 분석 결과 등을 계량 하는 모든 셀에 셀 표면에 대상 단백질 수준 계산, 다른 방법에 비해 셀; 당 평균 단백질 수준 그리고,이 독특한 기능은 중요 한 변화 요인, 다른 방법에서 최종 판독에 영향을 미치는 휴대폰 번호를 방지 합니다. 또한, 셀 몇 군데이 콘텐츠 이미징 방법으로 정량의 큰 수, 매개 변수는 복제, 분석 결과의 신뢰성에 추가 따라서 사이 잘 보였다 낮은 변형 당 모든 셀에서 평균.

이 프로토콜의 한계가 아니라 그것의 상대적으로 복잡 한 절차와 시간 이미징 접시 당 2 h HTS에 대 한 최고의 분석 다는 것입니다. 따라서, 우리는 5000 개 이상의 화합물과 큰 작은 분자 라이브러리 심사 분석 실험 대체 기자는 것이 좋습니다 하 고 집중된 특성 분석 실험 100 화합물에 제한에 대 한이 콘텐츠 이미징 프로토콜을 사용 하 여. 이 프로토콜의 두 번째 제한 셀 당 rhodopsin 단백질의 양 가진 선형 상관 관계에에 금성 형광 또는 immunostaining 형광 강도 인지 표시 하는 표준의 그것의 부족 이다. Immunostaining에 의해 포화를 피하기 위해, 테스트 및 1 차 및 이차 항 체의 다른 농도와 알을 품는 세포의 immunostaining 농도 플롯 하는 것이 좋습니다. 개화의 선형 범위 내에서 항 체 농도 선택 합니다.

현재 응용 프로그램에서 확대, 우리 정도 10 화합물까지 치료에서이 화합물의 약리 데이터베이스를 생성 하 28 다른 rhodopsin 돌연변이와 페 셀의 이미지에서 rhodopsin 전송 계량 것입니다. 이러한 rhodopsin 돌연변이 나르는 adRP 환자에 게 잠재적인 치료의 지도 위한 활동. 이 프로토콜의 질병 misfolding 다른 단백질의 약물 발견에 대 한 도움이 될 것입니다 어떤 막 단백질의 전 분석에 쉽게 적응 수 있습니다 또한.

저자는 공개 없다.

피츠버그 대학 신약 연구소이 콘텐츠 영상 및 초기 교육을 제공 하 고 우리 박사 마크 E. Schurdak를 감사 합니다. 아낌없이 박사 크 Palczewski (케이스 서쪽 예비 대학) 공유 하는 1D 4 및 B630 안티 rhodopsin 항 체. 마우스 rhodopsin 금성 건설의 cDNA를 포함 하는 플라스 미드는 박사 네 빈 램버트 (오 거 스타 대학)에 의해 공유 되었다. 이 작품은 피츠버그 대학 비전 연구 코어 보조금에서 YC를 P30EY008098 건강 그랜트 EY024992의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.