Cytokine Profiling Immunoassay Cytometric 구슬-기반 플랫폼을 사용 하 여 자극된 마우스 Splenocytes의 다중화

이 프로토콜에서는 조직 문화 supernatants 자극된 마우스 splenocytes 다중 구슬 기반된 immunoassay 플랫폼 및 교류 cytometer 사용 하 여에서 수집에 동시에 여러 cytokine 목표의 정량화를 설명 합니다.

비드 기반 immunoassays 샌드위치 immunoassays로 동일한 기본 원칙을 사용합니다. 구슬, 크기와 내부 allophycocyanin (APC) 형광 강도 의해 분화 될 수 있다, 항 체는 특정 분석에 활용 된 캡처. 다음, 정의 된 캡처 구슬 세트의 선택한 패널 캡처 항 체를 특정 대상 analytes를 포함 하는 생물 학적 샘플 알을 품는. 칵테일는 biotinylated 탐지 항 체에 추가, 캡처 구슬-분석-탐지 항 체 샌드위치의 형성에 이르게 합니다.

마지막으로, streptavidin phycoerythrin (SA-PE) 추가 됩니다, biotinylated 탐지 항 체, 바운드 분석의 금액에 비례하여 형광 신호 강도 제공 하는 바인딩. PE는 형광 분석 관련 구슬 영역의 신호 cytometry를 사용 하 여 계량은 및 특정 analytes의 농도 데이터 분석 소프트웨어와 분석 결과에서 생성 된 표준 곡선을 사용 하 여 결정 됩니다.

이 실험에서 사용 마우스 T 도우미 cytokine 패널 마우스 splenocytes 다양 한 물질로 조건 하에서 경작된에서 수집 하는 조직 문화 supernatants의 13 별도 cytokine 대상 들의 농도 동시에 계량 합니다.

그들의 역할에서 녹는 신호 분자, cytokines 높게 조정 하 고 multifactorial 프로세스 호스트 면역학 응답을 제어 하는 중재. 그들은 해상도, 개시에서 선 동적인 과정의 모든 단계 동안 표명 하 고 그들의 자신의 합성과 그들의 세포질 수용 체¹의 포함 하는 복잡 한 상호 작용 네트워크 규제. 이 통신 네트워크는 개별 구성 요소 간에 존재할 수 있는 시너지 또는 대립 관계를 넘어 복잡 계층입니다. 실제로, 많은 cytokines 공유 중복 또는 적어도 부분적으로 겹치는 기능^2,3으로 알려져 있습니다.

동시에 여러 cytokine analytes 계량 통합된 시스템 생물학 접근 현재이 여러 질병을 기본 면역 응답을 통합 하는 독특한 cytokinomes의 점점 더 포괄적인 이해를 제공 하는 ^4,5상태. 이러한 질병 상태에 이르기까지 일반적인된 염증 암, 신경 퇴행 성 조건, 및 심혈 관 질환^6,7,,89.

이러한 사이토카인 네트워크 LEGENDplex 구슬 기반 immunoassays를 사용 하 여 효과적으로 심문 수 있습니다. 이 분석 실험 Enzyme-Linked Immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 샌드위치와 같은 원리에 기반 하 고 covalently 그들의 표면에 부착 된 캡처 항 체와 형광 인코딩된 스피어를 사용 합니다. 이 항 체는 전통적인 ELISA 형식으로 필요한 것 보다 훨씬 더 작은 표면 영역에 움직일 수 있습니다. 이 같은 분석 실험을 훨씬 적은 샘플 볼륨으로 동시에 여러 analytes의 분석 다중화 일반적인 바인딩 및 제공 하는 동안 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과 13 목표까지 동시에 quantitate에이 기술을 활용 합니다. 이 분석 결과에서 데이터 다양 한 일반적으로 사용 가능한 흐름 cytometers 사용 하 여 얻어질 수 있다 고 다른 사용 가능한 분석 실험과 달리 전용된 분석 결과 특정 장비를 사용 하 여를 필요 하지 않습니다. 유효한 분석 패널의 확대 카탈로그,이 분석 실험 몇 가지 지속적인 생물 의학 연구 프로젝트^10,11,,1213에 사용 되었습니다.

용이성 및 유틸리티 분석 결과 형식 마우스 도우미 cytokine 패널 quantitate를 사용 하 여이 실험의 13 마우스 splenocytes 다중 아래 양식에서 얻은 조직 문화 supernatants에서 사이토카인 농도 분리 물질로 조건입니다. 조직 문화 supernatants 이외에이 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 혈 청 또는 혈장 샘플을 사용 하 여.

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 포함 된 NIH 권장 사항에 따라 수행 하 고 BioLegend에 IACUC에 의해 승인 했다.

그림 1: 필터 플레이트 분석 결과 절차 요약. 필터 플레이트를 사용 하 여 분석 결과 수행 하기 위한 프로토콜 분석 결과 주요 구성 요소와 인큐베이션 단계를 묘사한 다이어그램으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1. 생물학 견본 준비

참고: 선택한 해 부 사이트와 혈액 컬렉션의 볼륨은 각 개별 수 사관의 재량에 왼쪽과 분석 결과의 결과는 영향을 미치지 것입니다. 그러나, 그들은 얻을 수 있습니다, 일단 샘플 처리 아래에 나열 된 단계에 따라.

1. 혈 청 샘플의 준비
   1. 원하는 양의 기본 컬렉션 튜브에 혈액을 수집 하 고 적어도 30 분에 대 한 응고
   2. 샘플 실 온에서 1000 x g에서 10 분 원심.
   3. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 혈 청 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 ≤-20 ° c.
2. 플라즈마 샘플 준비
   1. 혈액 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 사용 하 여 원하는 양의 혈액 컬렉션 튜브를 코팅 하는 수집.
   2. 컬렉션의 실내 온도 30 분 이내에 1000 x g에서 10 분 원심 분리기.
   3. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 플라즈마와 분석 결과 즉시, 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 ≤-20 ° c.
3. 조직 문화 표면에 뜨는 샘플의 준비
   1. 샘플 셀 및 파편 제거 하 4 ° C에서 1500 x g에서 10 분 원심.
   2. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 상쾌한 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 수집 하 고 저장 ≤-20 ° c.
4. 녹고 냉동 생물 샘플의
   1. 완전히 녹여 얼음, 그리고 사용의 앞에 짧게 소용돌이에 모든 이전 냉동된 생물 학적 샘플. 2 개 이상의 동결/해 동 주기를 방지.
      참고:이 프로토콜에 사용 되는 샘플 BALB/c 마우스 splenocytes를 경작 하 여 얻은 했다 (37 ° C + 5% CO ₂ 다양 한 조건에서 1 x 10 ⁶ 셀: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL 플레이트 코팅) + αCD28 (1 µ g/mL 녹는), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). 문화 supernatants 48 h 후 수집 된 고 1.3 섹션에서 설명한 대로.

2. 시 약 준비

1. Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized 구슬
   1. Sonicate 미리 혼합된 구슬 병 실 온에 30 s 이전 사용에 대 한 다음 소용돌이 sonicator 목욕에서 1 분. Sonicator 목욕을 사용할 수 있는 경우와 동 시간 1 분을 증가
2. 준비의 워시 버퍼
   1. 가져와 20 x 워시 버퍼 (1 %20 x PBS 트윈-20) 실내 온도와 솔루션으로 모든 염 려 소용돌이 키트와 함께 제공 된.
   2. 475 mL 이온된 물으로 워시 버퍼 x 20의 25 mL를 희석. 2 ° C와 1 달까지를 위한 8 ° C 사이 저장소 사용 하지 않는 부분.
3. 매트릭스 B 준비 (사용을 위해 혈 청 및 혈장 샘플만)
   1. 분석 결과 버퍼 (1 %BSA PBS)의 완전 한 reconst에 대 한 동결 건조 된 매트릭스 B. 허용 최소 15 분을 포함 하는 병을 키트에 포함 된 5.0 mL를 추가 itution, 다음 잘 섞어 소용돌이 남은 재구성된 매트릭스 B에 저장 될 수 있다 ≤-70 ° C 까지의 한 달.

3. 표준 준비

참고:이 패널에서 각 분석은 10000 pg/mL의 최고 표준 농도.

이 프로토콜은 동시에 교류 cytometer를 사용 하 여 생물 학적 샘플에서 cytokine 프로필을 quantitate 하 immunoassay 구슬-기반 플랫폼을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 예제에서 사용 하는 생물 학적 샘플 분석 결과 형식 또한 혈 청 또는 혈장 샘플 사용에 대 한 검증 된 있지만 셀 문화 supernatants 했다 이전 다양 한 활성화 조건에서 알을 품는 마우스 splenocytes에서 했다.

분석 결과에서 생성 된 데이터는 멀티플렉스 패널에 모든 analytes에 대 한 표준 곡선을 생성 하는 데 사용 됩니다. 데이터 분석 소프트웨어 각 특정 분석 독특한 구슬 크기와 APC 강도에 따라 분류 하 고 체육 기자를 사용 하 여 그들을 단정. 그림 2A에서 로그-로그 규모에 때 분석 결과의 감도 서 동적 범위는 설명 했다. 소프트웨어 분석 결과 데이터를 사용 하 여 및를 정확히 계산 하는 사용자에 analytes의 농도 뿐만 아니라 5 매개 변수 곡선 맞춤 알고리즘 제공 모든 표준 곡선 (표 1의 높고 낮은 끝에 생물 학적 샘플 뿐만 아니라 탐지의 한계 ). 이 프로토콜에서 설명 하는 형식 또한 매우 강력한 분석 결과 정밀도를 제공 합니다. 그림 2B 와 2c 에서 데이터의 각 분석 내부 분석 결과 다양성 묘사 되 게 됩니다. 두 개의 별도 표준 단백질 농도 (높거나 낮은) 한 분석 결과 각 샘플에 대 한 16 복제에에서 분석 되었다. 그림 2C 와 2D 3 개의 독립적인 분석 실험에서 대상 analytes 간 분석 결과 변화를 나타냅니다. 내부 분석 결과 정밀 실험과 높고 낮은 표준 농도 3 분석 했다 독립적인 실험의 각 복제 합니다. 대상 단백질의 계산 된 농도에서 최소한의 변화 명확 하 게 표시 됩니다.

Cytokine 식 프로필 질문에서 구슬 기반 cytometric 분석 유틸리티를 보여 주기 위해 마우스 splenocytes 다양 한 활성화 조건 하에서 인 큐베이 팅 했다. Unstimulated 컨트롤 뿐만 아니라 셀 LPS, 안티-CD3/안티-CD28 항 체 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트와 ionomycin incubated도 했다. 셀 문화 supernatants 48 h 나중 및 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 분석을 수집 했다. 이 실험에서 정량화 결과 그림 3 에 표시 되 고 사이토카인 농도에 자극의 효과 명확 하 게 delineated.

위에서 설명한 결과 실험 좋은 실험실 기술을 하 고 제공 된 분석 결과 프로토콜을 다음과 같이 전형적, 이다. 이 분석 결과 형식 오류의 소스 샘플을 분석 하는 데 사용 하는 교류 cytometer에서 보육 시간, 시 약 볼륨, 세척, 편차 또는 부적 절 한 PMT 설정에서 발생할 수 있습니다. 그림 4A 분산형 플롯 성공적인 분석 결과에서 명확 하 게 정의 된 2 가지 구슬 인구를 보여줍니다. 이 그림 4B, 어디 가난한 세척 및 프로토콜 준수 이끌어 두 개의 인구 블러 비드 집계에 대조 될 수 있다. 또한, 낮은 왼쪽된 사분면에서 파편에 의해 입증, 총 cytometer 이벤트 분석 보다는 문이 이벤트만의 기본 형식에 대 한 수출 되었다. 적절 한 cytometer 설정 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 하는이 분석 결과에 중요 하다. APC 분류 채널에서 6 analytes의 각각의 해상도 그림 4C 적절 한 PMT 설정을 사용 하 고. 부적 절 한 PMT 설정 비슷한 그림 4D 어디 송출 채널은 겹치는 분류 농도와 구슬 인구에에서 제공 된 데이터에서 발생 합니다. 분석 농도 분석 결과 구슬의 명확 하 게 정의 된 인구 없이 계산 가능한 것이 분석 결과 무효화 됩니다.

그림 2: 표준 곡선 범위와 분석 결과 정밀도. (A)는 대표적인 표준 곡선 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 생성. 표준 곡선 각 분석 결과 함께 실행 되어야 합니다. (B-C) 내부 분석 결과 정밀도입니다. (높고 낮음) 대상 단백질의 다른 농도 함께 두 개의 샘플은 각 샘플에 대 한 16 복제 한 분석 결과에 분석 되었다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시 됩니다. (D-E) 간 분석 결과 전체 자릿수입니다. 대상 단백질 (높고 낮음)의 다른 농도 함께 두 개의 샘플은 각 샘플에 대 한 3 복제와 3 개의 독립적인 분석에 분석 되었다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 대표 결과의 정량화. 마우스 splenocytes (1 x 10⁶ 셀) 37 ° C + 5% CO₂ 다양 한 조건 하에서 경작 했다: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL 플레이트 코팅) + αCD28 (1 µ g/mL 녹는), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). 문화 supernatants 48 h 후 수집 된 다음 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 계량 합니다. 차동 cytokine 식 프로필 자극 조건에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 실패 분석 실험 대 성공에서 유래한 다. (A) 성공적인 분석 스피어 인구에 대 한 뚜렷한 비드 인구 있을 것 이다. (B) 가난한 인구의 분리, 비드 집계 및 너무 많은 수집된 이벤트 실패 분석 할 것 이다. (C) 성공적인 분석은 명확 하 게 정의 농도 게이트, 계량 하기 쉬운 분류 형광 채널에서. (D) 실패 분석은 제대로 분리 및 정량화를 어렵게 만드는 여러 구슬 인구 중복 분류 농도. 이러한 오류 분석 결과 프로토콜에 주의 깊은 부착을 통해 피할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 표준 곡선 피팅 및 분석 결과 감도. 데이터 분석 소프트웨어는 다중 분석 결과에 포함 된 모든 analytes에 대 한 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 되었다. 이 완전 자동화 된 분석 분석 결과에서 희석 시리즈 표준 알고리즘을 피팅 강력한 5 매개 변수 곡선을 적용 하 고 또한 분석 결과 감도 검색의 이론적인 한계를 사용 하 여 정의 하는 데 사용 했다.

실험을 제공 하는 생물 학적 샘플 프로 파일 녹는 중재자의 강력한 정량화는 좋은 실험실 기술 및 권장된 프로토콜에 부합이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과 형식을 제공할 수 있습니다.

신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위하여 따라야 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 재조합 형 기준 분석 결과 버퍼 권장, 풀 타임에만 폴 리 프로필 렌 튜브에 희석 후 다시 구성할 허용 되어야 합니다. 폴리스 티 렌 튜브는 표준 곡선을 생성할 때 낮은 신호를 이어질 수 있는 튜브의 벽에는 단백질의 준수를 홍보할 수 있습니다. 둘째, 적절 한 인큐베이션 단계 동안 떨고 하는 것이 중요 합니다. 적절 한 동요 없이 분석 결과 구슬의 바인딩 특성은 심각 하 게 방해 될 수 있습니다. 또한, 인큐베이션 단계 사이의 적절 한 세척 필요 이기도합니다. 실험 프로토콜에는 다음 단계를 시작 하기 전에 우물에서 초과 시 약 제거 됩니다 확인 해야 합니다. 분석 결과 구슬 심문 하는 데 사용 하는 교류 cytometer 악기 설정 또한 낙관 되어야 한다. 특히, PMT 설정은 적절 한 비드 분리 하 고 표준 곡선에 대 한 광범위 한 동적 범위를 조정 해야 합니다. 마지막으로,는 cytometer에 분석 되 고, 직전 구슬 vortexed 적절 한 정지를 보장 하 고 집계 결과 왜곡 수는의 형성을 피하기 위해 해야 합니다.

이 프로토콜 연구원은 크고, 전체 격판덮개 분석 실험을 수행 하기 전에 그들의 세포의 용 해 프로토콜을 최적화 하고자 제공이 원고에서 설명 하는 샘플 형식으로 조직 homogenates 분석 하 잠재적으로 수정할 수 있습니다. 실제 기술 과정에 따라 달라질 수 조직 유형; 그러나, 일반적으로 프로토콜 중립 pH 버퍼 이오니아 소금의 생리 적 농도, 아니 변성 화학 물질, 그리고 가급적 이면 아무 세제 사용 해야 합니다. 세제를 사용 해야 하는 경우 비 이온 세제 농도 최소 (예: 더 이상 1%)에서 유지 되어야 한다. 버퍼 또한 대상 단백질의 분해 성능 저하를 방지 하기 위해 충분 한 protease 억제제를 포함 해야 합니다. 사용 되는 세포의 용 해 프로토콜에 최종 준비 분석 전에 미 립 자 제거를 centrifuged 한다.

분석 결과 제한에 관한 생물 학적 샘플 유형에서 분석 대상의 농도 크게 달라질 수 있습니다. 제대로 계량 분석 농도, 하기 위해서는 그들이 표준 곡선에 대 한 위쪽 및 아래쪽 값에를을 해야 합니다. 곡선의 값의 추정은 반드시 신뢰할 수 고 하지 것이 좋습니다. 조사자는 따라서 풀 플레이트 분석 결과 실행 하기 전에 파일럿 실험에 그들의 특정 샘플의 희석을 최적화 해야 합니다. 또한, 수 분석을 생물 학적 샘플의 주의 준비는이 분석 결과의 성공에 있어서 최우선 이다. Lipemic, hemolyzed, 또는 단백질 파편을 포함 하는 샘플이이 immunoassay의 핵심 원칙을 정의 하는 항 원 항 체 상호 작용에 영향을 미칠 하 고 해석할 수 있는 결과 렌더링.

이 분석 여러 가지 이유로 기존의 정량화 방법에 관하여 중요 하다. 제대로 실행 될 때 시험 형식 전통적인 ELISA 분석 실험을 사용 하 여 샘플을 분석 하는 데 필요한 것 보다 훨씬 작은 볼륨을 사용 하 여 샘플에서 최대 13 analytes를 quantitate 수 있습니다. 이 분석 결과 형식은 또한 수행 하려면 전용된 장비를 필요 하지 않습니다. 이것은 일반적으로 사용 되는 교류 cytometers의 어떤 숫자를 사용 하 여 분석 결과 실행할 수 있는 다른 상용 구슬 기반 immunoassays에 비해 이점이 다.

역할에 과학적 탐구 분 비 요소와 cytokine 네트워크 건강에서 하 고 질병 확대. 분석 결과 형식이이 원고에 설명 된 이러한 다양 하 고 복잡 한 현상을 이해 하고자 하는 연구자에 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 활성 생물 의학 연구 프로그램 뿐만 아니라 지역 같은 일반 염증⁶, cytokine 네트워크의 역할 뿐만 아니라 동맥 경화, 암, neuroinflammation ^{등 특정 질병 상태에 맥락을 탐구 하기 시작 15,,1617}. 의심할 여 지 없이, 조사는 이러한 만성 질환 치료에 새로운 치료제에 대 한 검색 확장으로이 지역에서 성장 계속 됩니다. 이 질병와 관련 된 성 중재자의 정확 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 대 한 필요성은 중요 한 연구 우선권 유지 됩니다.

저자는이 원고에 설명 된 시 약을 제조 하는 BioLegend에 의해 고용 됩니다. Vigene 기술, i n c.는이 원고에 설명 된 분석에서 생성 된 데이터를 분석 하는 데 사용 되는 LEGENDplex 데이터 분석 소프트웨어를 개발 했다.

저자 바이오 마커 및 면역 분석 실험의 기여를 인정 하고자 제품 개발 팀의 분석 결과 개발. 또한, 우리는 데이터 분석 소프트웨어 패키지 설계에 그들의 공동 노력에 대 한 Vigene 기술, i n c.를 감사 하 고 싶습니다.