인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.

인플루엔자 바이러스는 호스트 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력을 전시 한다. 한 가지 방법은 바이러스의 표면 glycoproteins에서 발생 하는 항 원 변화를 통해 이다. 탈출 이체의 세대에 elucidating 바이러스 면역 검출을 탈출 하는 방법을 식별 하는 항 체 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물에 강력한 방법입니다. 여기, 우리 인플루엔자 A 바이러스도 변종 바이러스 성 조류 (HA)에 대 한 감독 또는 murine 단일 클론 항 체 (mAbs)를 이용 하 여 생성 하는 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 기술 사용 하 여 우리는 이전 중요 한 잔류물 머리 나는 새로운 조류 H7N9 하의 줄기를 대상으로 항 체 바인딩을 위한 필요한 특징. 프로토콜은 다른 바이러스 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다. 탈출 이체의 분석은 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 저항 및 바이러스, 부여 결정 항 원 편 류를 모델링 및 백신 치료제의 설계에 중요 합니다.

다른 RNA 바이러스와 마찬가지로, 인플루엔자 A 바이러스는 다양 한 항 원 이체 복제^1,2,3의 각 라운드의 생성을 허용 하는 오류 중 합 효소를 소유한 다. 인플루엔자 바이러스는 항 체 바인딩의 손실에 지도 하는 표면 glycoproteins에 돌연변이의 축적을 통해 달성 된다 항 원 편 류를 통해 인간의 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력. 바이러스 성 표면 glycoproteins, 하 및 응집 (NA)의 항 원 편 류를 다르게 매년 백신을 관리 하 고 필요를 필요로 합니다.

격리 및 항 원 특정 항 체의 생성 기술 발전 백신 유도 mAbs^4,5,6,,78의 높은 수를 얻지 못했다. 차례로, 인플루엔자 A 바이러스를 광범위 하 게 중화 mAbs의 epitopes의 특성은 크게 주 었 여러 범용 인플루엔자 백신 후보자^{9,,1011의 개발 12,,1314}. mAb의 항 원 발자국 elucidating 중립화의 구조적 결정 요인 밝혀 고 백신 디자인으로 정보 접근에 대 한 수 있습니다. 그러나, 그것은 현실도 구조적으로 바이러스 성 항 원^15, 에 epitopes를 지도 하기 위하여 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법을 통해 mAbs의 광범위 한 패널 특성 실험실에 대 한 비용 효율적인 ^{16 , 17 , 18}.

엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법 고가의 장비, 전문된 기술 및 잠재적으로 광범위 한 양의 데이터를 생성 하는 시간이 필요 합니다. 대체 하 고 빠른 접근 활용 오류가 RNA 의존을 통해 다양 한 바이러스 인구의 급속 한 세대 mAbs^{19,20의 epitopes를 결정 하기 위해 탈출 돌연변이 생성에 RNA 중 합 효소 21,,2223}. 이스케이프 변종의 생성 어떤 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하지 않는다 고 기존의 실험실 시 약 및 장비와 함께 수행할 수 있습니다.

여기, 인플루엔자 HA를 인식 하는 mAb 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물의 매핑 허용 하는 방법을 설명 합니다.

주의: 인간의 인구 (예를 들어, H1, H3)에서 순환 하는 인플루엔자 바이러스의 수는 biosafety 수준 2 클래스 병원 진료와 적절 한 개인 보호 장비 처리 해야 합니다. 바이러스의 처리 기관 검토 위원회에 의해 승인을 받아야 한다. 다음 프로토콜 시내산에서 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

참고: 바이러스 성 복제를 억제 하 특정 항 체는 i) 바인딩 또는 구형 머리 위에 수용 체 바인딩 사이트의 인접 한 사람과 말 초 수용 체 바인딩의 바인딩 ii) 것 들으로 일반적으로 분류 될 수 있다 도메인, 구형 머리의 측면 사이드와은 하의 줄기 지역 포함. 항 체 수용 체 바인딩 사이트 대상 대상 세포의 표면에 sialic acid 모티프의 교전을 방지 하 고 hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과 사용 하 여 측정 될 수 있다. 이 음수가 되는 항 체 줄기 특정 항 체와 같은 아직도 바이러스의 복제를 억제할 수 있는 하지만 중화 분석 실험을 사용 하 여 평가 될 수 있다.

1. 항 체 안녕 및 중화 활동에 따라 분류

1. 안녕 분석 결과
   1. 96 잘 V-하단 플레이트에 열 2 12에 1 x PBS의 25 µ L 추가.
   2. 희석 mAb 7B2 (머리 전용), 6F12 (스토킹 관련) ²³와 100 µ g/ml PBS와의 열 1에 희석된 항 체 준비 aliquot 50 µ L x 1에 isotype 컨트롤. 또한 아무 mAb 컨트롤 1 x PBS ( 그림 1A)의 50 µ L을 추가 하 여 포함.
   3. 열 2, 열 1에서에서 25 µ L를 전송 하 여 항 체의 2-fold 직렬 희석을 수행 하 고 등등. 삭제는 마지막 25 µ L에서 열 12 ( 그림 1A).
      참고: 확인 하십시오 항 체 통제의 행을 포함 해야 합니다.
   4. 8 hemagglutination 단위/25 µ L 희석 바이러스 재고 바이러스 주식 (reassortant 바이러스는 HA와 NA의 A/캘리포니아/04/09 내부 세그먼트 A/Puerto 토 리코/8/34의 표현)을 희석. 각 음 (행 A g)를 희석된 바이러스 주식 (8 hemagglutination)의 25 µ L을 추가.
      참고: 항 체와 바이러스 혼합 50 µ g/mL의 시작 최종 농도 50 µ L의 최종 볼륨 있어야 합니다.
   5. 품 45 분에 대 한 상 온 (RT) 접시
   6. 다시 적정 행 (H), 추가 1 x PBS의 50 µ L 우물 H2에 H12. H1 잘 8 hemagglutination 단위/25 µ L의 100 µ L를 추가 합니다. 직렬로 h 1에서 h 2를, 50 µ L를 전송 하 여 2 배 희석 하 고 등등. 잘 H12에서 마지막 50 µ L를 삭제 합니다. 마지막으로, 96-잘 V-바닥판의 모든 우물을 0.5% 닭 포 르 트 드 적혈구 (RBC)의 50 µ L을 추가.
      참고: 분석 결과에서 mAb 샘플 100 µ L의 최종 볼륨 있어야: mAb (25 µ L), 바이러스 (25 µ L) 및 증권 (50 µ L). 없는 mAb 컨트롤의 마지막 볼륨 PBS x 1의 25 µ L, 바이러스의 25 µ L, RBC의 50 µ L를 포함 해야 합니다.
   7. 품 1 h. 4 ° C에서 접시
   8. 는 시각적으로 활동에 대 한 번호판을 읽기. 경우에 특정 항 체에 대 한 긍정적인 판독, 2.1 탈출 변종 생성 단계로 진행 합니다. 항 체가 부정 인 경우에, 항 체는 세포 문화 분석 결과에서 활동을 중화 하는 경우 평가 하기 위해 1.2 단계로 아래 진행.
      참고:이 활성 mAb의 긍정적인 판독 했을 때 96 잘 V-바닥판은 45 ° 각도로 눈물 드롭 양식 것 이다 잘 ( 그림 1B 7B2)의 센터에 어두운 빨간색 RBC 펠 릿으로 표시 됩니다. 부정적인 판독 ( 그림 1B 6F12 및 아무 mAb) 잘 어두운 빨간색 RBC 펠 릿을 형성 하지 것입니다. Isotype 컨트롤 것입니다 어두운 레드 로얄 펠 릿 형성 하지도 고 한다 모양 줄기 특정 항 체, 6F12 또는 아무 mAb 동일한 제어 샘플 ( 그림 1B) ²³.
2. Microneutralization 분석 결과
   1. 플레이트 Madin 다 비 개 신장 (MDCK) 셀 셀/잘 조직 문화에서에서 2 x 10 ⁴의 밀도에서 96 잘 접시 취급 하 고 37 ° C, 5% CO ₂ 17 19 h에서 품 어 .
      참고: 셀 허용 될 수 사용 하기 전에 4 h의 최소 우물의 바닥에.
   2. 7 수행 하는 별도 96 잘 접시 인간의 mAb 4 D의 3 연속 희석 05 ⁵, CR9114 ¹⁷ 또는 isotype IgG 제어, 200 µ g/mL의 최소한의 필수 매체 (MEM) X 1에 토실기 보충 시작 농도에 phenylalanyl chloromethyl 케 톤 (TPCK)-트립 (1 µ g/mL) 신 대우 ( 그림 2).
      참고: 행 A (시작 200 µ g/mL의 농도) 희석된 항 체의 75 µ L를 포함 해야 합니다. 직렬 (3-fold) 행 A 행 B, 25 µ L를 전송 하 여 접시를 희석 하 고 등등. 행 A H 50 µ L의 최종 볼륨을 가져야 한다. 저기 팁 희석 전송 사이 변경할 필요가 없습니다.
   3. 희석 바이러스 주식 (reassortant 바이러스는 HA와 NA의 A/상하이/1/13 내부 세그먼트의 A/Puerto 토 리코/8/34) 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID ₅₀)의 100 / 1 x에서 50 µ L MEM TPCK 처리 보완 트립 신 (1 µ g/mL) ²⁴. 50 µ L/잘 희석된 바이러스의 항 체 준비 (단계 1.2.2)에 추가 합니다. 감염 되지 않은 세포 제어 웰 스에 1 X MEM의 50 µ L을 추가.
   4. 1 헤에 대 한 (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 바이러스 항 체 혼합물을 품 어
      참고: 바이러스 항 체 혼합물 100 µ L의 총 볼륨 있어야 한다: 항 체 희석 (1.1.2 단계)의 50 µ L 및 100 TCID ₅₀ (1.2.3 단계)를 포함 하는 바이러스의 50 µ L.
   5. 우물에서 미디어를 발음 하 고 추가 바이러스 항 체 혼합물의 전체 100 µ L 해당 우물.
      참고: 포부 이루어집니다 진공 흡 인기 8 채널 어댑터를 사용 하 여 연결할. 또는 수동으로 발음 하는 8 또는 12 잘 멀티 채널 마이크로-피 펫을 사용할 수 있습니다. Inoculum 제거 하거나 세척 하는 동안 모든 소망이 이루어집니다 항 체의 높은 농도에서 낮은, 변경할 필요가 팁 없이.
   6. 1 x PBS의 200 µ L로 단층 세척. 1 x PBS (1.2.5 단계)에서 200 µ L 발음 2 세척의 총에 대 한 세척을 한 번 더 반복.
   7. 감염 단층 및 감염/1 헤 (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C에서 품 어 (1.2.4 단계)에서 바이러스 항 체 혼합물의 전체 100 µ L/우물을 추가 하 여 MDCK 세포의 단층
   8. 별도 96 잘 접시에 감염 시 항 체 희석의 또 다른 세트를 준비. 150 µ L 추가 행에서 각 항 체의 100 µ g/mL 및 1 x 100 µ L의 MEM 보충 TPCK 치료 (1 µ g/mL) trypsin H. 수행을 행 b에서 3 희석 행 b 행 A에서에서 50 µ L를 전송 하 여 행 H. 삭제 행 헤에서 마지막 50 µ L까지 등등, 각각에 대 한 전체 볼륨은 잘 100 같아야 µ L. 설정 제쳐두고.
      참고: 항 체는 1 x MEM TPCK 취급 트립 신 (1 µ g/mL)와 보완에 희석.
   9. 단계 1.2.7에서에서 단층에서 바이러스 항 체 inoculum을 발음 하 고 적절 한 항 체 희석 단계 1.2.8에서에서 준비의 전체 100 µ L/우물과 보충.
      참고: 잘 포함 하는 경우 감염 (1.2.7 단계) 다음 보충 미디어 중 100 µ g/mL의 최종 항 체 농도 또한 100 µ g/mL (단계 1.2.8)의 최종 항 체 농도 포함 해야 합니다.
   10. (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 24 h에 대 한 품.
   11. 96 잘 접시에서 미디어를 발음 하 고 세 번 1 x PBS의 200 µ L/잘 씻어.
   12. 1 h-20에 대 한 차가운 80% 아세톤의 100 µ L로 셀 수정 ° c.
       참고: 80% 아세톤 솔루션은 두 배 증류수 (dd) H ₂ O (예를 들어, 100% 아세톤의 80 mL 플러스 ddH ₂ 0의 20 mL)에 희석. 80% 아세톤 솔루션 사용 하기 전에 얼음에 냉장 될 수 있다.
   13. 1 X PBS의 200 µ L/잘 셀 세 번 씻어.
   14. 블록 5% 우유의 200 µ L/잘 플레이트 1 X PBS에 희석 1 헤에 대 한 실시간에 번호판을 품 어
   15. Biotinylated 항 인플루엔자 nucleoprotein (NP) 기본 항 체의 추가 100 µ L 희석 1:2,000 PBS/1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) x 1에서 고 1 헤에 대 한 실시간에 번호판을 품 어
       참고: 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 전용 안티-NP 항 체를 사용 해야 합니다.
   16. 1 x PBS 가진 접시 세 번 씻어.
   17. 추가 100 µ L streptavidin-말 무 과산화 효소 (HRP) 어원이 항 체의 희석 1:3,000 PBS/1% BSA x 1에서 고 1 헤에 대 한 실시간에 번호판을 품 어
   18. 플레이트 1 x PBS의 200 µ L로 세 번 세척.
   19. 100 µ L/잘에서 HRP 기질 시 약을 추가 하 고 실시간에 어둠 속에서 품 어
       참고: 보육 시간 산 성 정지 버퍼 (아래)의 추가 하기 전에 최적화 되어야 합니다. 일반적으로, 15 ~ 30 분은 충분 한.
   20. 담금질 5 M HCl의 50 µ L/잘 반응.
       주의: 5 M HCl은 눈, 피부 및 점 막에 손상을 일으킬 수 있는 높은 부식성 시 약. 이 시 약의 추가 적절 한 개인 보호 장비와 배기 후드 아래 이루어져야 합니다.
   21. 492에 번호판을 읽기 nm 배경 (감염 되지 않은 세포) 웰 스를 뺍니다.
   22. 계산 다음 수식 사용 하 여 비율 억제:
       
   23. 경우 항 체 중화 활동 (그리고이 활동이), 2.2 단계로 진행.
       참고: 항 체 중화 활동 생체 외에서 부족이 활동 부족 합니다.

2. 세대 탈출 돌연변이 변종의

참고: 안녕 활동 부족 또는 중화 항 체는 더 아래에 설명 된 특정 프로토콜 분석.

1. 프로토콜 1: 안녕-긍정/중화-긍정적인 항 체 ( 그림 3A )
   1. 10의 바이러스 주식 준비에 1 x PBS에서 단위/밀리 리터 (PFU/mL)를 형성 하는 ⁶ 패 400 µ L 볼륨.
   2. 4 희석 농도 증가의 항 체의 준비 (예를 들어, 0, 0.5, 0.05 및 0.005 mg/mL) 희석 당 100 µ L의 볼륨에서 1 x PBS에.
      참고: 병렬에서 및 항 체의 부재에서 야생 형 바이러스 항상 passaged 한다. 이러한 passaged 바이러스의 시퀀스 문화 조건 세포에 돌연변이 탈출 적응 사이 구별에 도움이 될 것입니다.
   3. 믹스 100 µ L 10의 ⁶ 각 항 체 희석의 100 µ L 또는 1 x PBS의 100 µ L 바이러스의 PFU/mL.
   4. 품 (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 1 시간 짧게 소용돌이입니다. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) embryonated 계란 각 혼합물의 200 µ L 주입.
   5. 40-44 헤 (CO ₂) 없이 37 ° C에서 알을 품 어
   6. 6 헤 최소 4 ° C에서 배양 하 여 바이러스 감염 embryonated 계란을 희생
   7. 수확 allantoic 액체 계란에서 앞에서 설명한 ^{24 , 25}.
   8. ^{24 , 26} 위에서 설명한 대로 hemagglutination 분석 결과 수행 합니다. Allantoic 액체 준비 hemagglutination titers 없다면, 항 체 희석 0.00005 mg/mL까지 0.005 mg/mL에서 2 단계에서 반복.
      참고:이 긍정적인 항 체의 saturating 농도 현재 모든 바이러스 입자를 무력화 수 있습니다. 따라서, 그것은 뿌리고에 존재 하는 항 체의 양을 감소 해야 할 수 있습니다.
   9. 확인에서 수행 하 여 탈출 변형 시험 ²⁴ (단계 1.1).
      참고:이 활성 항 체 차단 대상 셀에 sialic acid 모티프의 HA 약혼. 따라서, 그것의 동족 항 체의 존재 바이러스 능력 agglutinate Rbc (로얄 펠 릿의 존재)을 잃는다. 이론적으로,이 활성 항 체의 탈출 변종 아직도 그것의 동족 항 체의 존재도 sialic acid 모티브를 바인딩할 수 있습니다 하 고 따라서 Rbc (로얄 펠 릿) agglutinate 수 있습니다. 관심의 항 체의이 여전히 감지, 반복 단계 2.1.2 항 체의 높은 시작 농도에서 프로토콜.
2. 프로토콜 2: 안녕-부정/중화-긍정적인 항 체 ( 그림 3B )
   참고: 안녕 부족 하는 항 체를 중화 하는 것에 대 한 탈출 이체를 생성 하려면 활동, 바이러스 항 체의 양을 증가 존재 passaged 해야 합니다.
   1. 1 x 10 ⁶의 밀도에서 6 잘 플레이트에 플레이트 MDCK 셀 셀/잘 및 최소 4 h (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 품 어.
   2. 10 바이러스 주식 희석 ⁶ PFU/mL 또는 1에서 이전 통로에서 바이러스 TPCK 치료 (1 µ g/mL) trypsin 500 µ L 볼륨에와 MEM x.
   3. 1에서 항 체 (0.02 mg/mL 원래 통로 대 한 이상에 대 한 모든 구절 다음)의 단일 희석 준비 250 µ L 볼륨에 트립 신 TPCK 처리와 MEM x.
   4. 믹스 250 µ L 희석 항 체 (+ 항 체)의 250 µ L로 희석된 바이러스 또는 1의 250 µ L의 MEM (항 체 제어) x.
   5. 바이러스 항 체 혼합물 (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 30 분을 품 어.
   6. 파스퇴르 유리를 사용 하 여 미디어 플라스틱 및 1 X PBS의 1 mL로 세포의 단층을 씻어 aspirate.
   7. 우물에 혼합물의 500 µ L을 추가 하 고 1 헤에 대 한 (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 품 어
   8. 1 시간 후 1의 2 mL와 함께 우물 보충 MEM TPCK 취급 트립 신 (1 µ g/mL)와 x.
   9. 현미경에 cytopathic 효과 (CPE)의 표시를 위해 48 h 후 감염에서 세포를 확인 하거나 바이러스 성장 ²⁶ 검색 hemagglutination 분석 결과 수행.
   10. 항 체와 보충 문화에서 총 CPE 경우 수확 여러 곳을 알아내는-튜브, 라벨에 상쾌한 통로 번호와 스토어-80 ° c.
   11. 저장 100 µ L 1 x 2 mL와 MDCKs의 신선한 단층 감염 상쾌한의 MEM TPCK trypsin 및 항 체와 보충. 모든 통로 대 한 항 체 제어 하지를 포함 하도록 하십시오.
       참고: 증가 항 체의 농도 (또는 연구원의 판단에) 두 배로 다음 통로 (매 2 일).
   12. 바이러스 성장 항 체의 0.6 mg/mL의 최종 농도와 여전히 가능한 때까지 각 연속적인 통행에 항 체의 농도 증가. 고정 각의 상쾌한의 여러 병 통로 및-80에서 저장 ° c.
       참고: 아무 항 체 컨트롤 확인 하는 다른 하나의 통로에서 바이러스의 성장에서 결정적 이다. 아니 항 체 제어에 총 CPE 하지만 아무 CPE에 경우는 + 항 체 그룹,이 항 체의 농도가 너무 높았다 고 아무 탈출 변종 생성 된 나타냅니다. CPE 아무 항 체 제어에 총만 중간에서 CPE는 + 항 체 그룹,이 잠재적인 탈출 이체의 존재를 나타냅니다. 다음 구절에서 통로 볼륨 상쾌한의 200 µ L 증가 하 고 탈출 변종 생성의 가능성을 증가 하는 항 체의 농도 유지.

3. 플 라크 정화를 통해 변종 탈출의 절연

1. 1 x 10 ⁶의 밀도에서 6 잘 플레이트에 플레이트 MDCK 셀 셀/잘 및 최소 4 h (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 품 어.
2. 1에서 항 체 희석 TPCK 처리 trypsin 해당 탈출 돌연변이 바이러스의 250 µ L 250 µ L의 믹스 볼륨에서 300 µ g/mL에서 시작 된 메모리 x. 바이러스 항 체의 부재에서 passaged 또한 플 라크 정화 해야 합니다.
3. 셀에서 미디어를 발음, 1 x PBS로 세 번 세척 하 고 바이러스 항 체 혼합물 (3.2 단계)의 전체 500 µ L을 추가.
4. 바위 앞뒤로 단층의 건조를 방지 하기 위해 모든 10 분 확인 하 고 (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 1 시간에 대 한 번호판을 품 어.
5. 바이러스 항 체 혼합물을 발음 하 고 오버레이 agar 미디어 항 체 (300 µ g/mL, 3.2 단계)의 해당 금액을 포함 하는 우물을 보충.
6. (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 40-44 h에 대 한 접시를 품 어.
7. 패 따기를 촉진 하기 위해 파란색 또는 검은 색 표시와 함께 표시 플 라크를 동그라미.
8. 각 선택 4 패 탈출 MDCK 세포 또는 항 체의 부재에 계란에 passaged 된 야생 형 바이러스로 돌연변이 바이러스 항 체 조합.
9. 1 x PBS의 100 µ L에서 플 라크를 resuspend.
10. 10 일 오래 된 SPF embryonated 계란 플 라크 정화 탈출 돌연변이 바이러스의 전체 100 µ L 주입.
11. 40-44 h (없이 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 알을 품 어.
12. 바이러스 (단계 1.1)의 존재를 확인 하는 hemagglutination 분석 결과 수행.

4. 바이러스 성 RNA와 분석의 하 시퀀스의 추출

1. 추출 바이러스 성 RNA 200 µ L.
   주의: 페 놀은 기침, 호흡 곤란을 일으킬 하 고 알맞게 접촉에 의해 피부를 자극 수 있는 휘발성 액체 시 약.
2. 증폭 바이러스 성 RNA 역전사의 사용에서 HA 세그먼트 및 인플루엔자 A 하 유전자 특정 뇌관 세그먼트 ²⁷.
   참고: 표 2에 설명 된 인플루엔자 B 바이러스에 대 한 보편적인 뇌관 증폭 두 하 (~ 1800 bp)와 나는 (~ 1500 bp) ²⁸.
3. 1 %agarose 젤에 RT-PCR 제품을 해결 및 올바른 크기의 밴드를 잘라 (~ 1800 bp).
4. 젤 추출 실리 카 멤브레인 기반 정화 절차를 사용 하 여 PCR 제품 및 시퀀싱는 cDNA를 발송.
5. 아미노산 잔류물에 돌연변이 차별화 하 여 항 체 바인딩 putative 탈출 변종에 발견 하 고 셀 문화 적응 또는 면역학 선택 야생 형 바이러스 passaged 필요한 식별.
6. 야생-타입을 포함 하는 PCR 제품을 복제 또는 변형 하는 pCAGGs 식 벡터 (노트 NheI)으로 탈출.
7. 탈출 변종 HA 항 체의 바인딩을 두 옵션 중 하나 (또는 둘 다) 아래에 설명 된 평가 될 수 있다.

5. 항 체 바인딩 분석의 탈출 변종

1. 면역 형광
   1. 플레이트 293T 세포 2 x 10 ⁴의 밀도에서 96 잘 접시에 셀/잘 고 24 h에 대 한 (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 품 어.
   2. 0.10 µ g/잘 인코딩 탈출 돌연변이 HA pCAGGS 플라스 미드의 셀 transfect, 바이러스 passaged HA, 및 transfection 시 약의 사용과 (unpassaged) 야생-타입 하.
   3. (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C 배양 기에서 48 h에 대 한 96 잘 접시를 품 어.
   4. 수정 100 µ L의 실시간에서 15 분 동안 0.5 %paraformaldehyde
      주의: Paraformaldehyde 기침, 호흡 곤란을 일으킬 하 고 알맞게 접촉에 의해 피부를 자극 수 있는 휘발성 액체 시 약 이다. 그것은 잠재적인 인간 발암 물질로 지정 되어 있다. 시 약의 추가 발명된 화학 후드에서 이루어져야 합니다.
   5. PBS 1 3 x와 워시 번입니다. 실시간에서 1 h 1 x PBS에 5% 우유와 함께 블록
   6. 1 x PBS 세 번 씻어. 실시간에서 1 시간에 대 한 관심의 항 체의 5 µ g/mL와 함께 품 어
   7. 이차 항 체 (항 인간 또는 반대로 마우스 알 렉 사 488) 1:2,000 PBS/1% BSA 어둠 속에서 RT에 1 h x 1에서의 희석에의 100 µ L로 품.
   8. 1 x PBS 세 번 씻어. 긍정적 이거나 부정적인 얼룩이 지기를 위한 형광 현미경에서 세포 관찰.
2. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)
   1. 플레이트 293T 세포 2 x 10 ⁵의 조밀도에 셀/6-잘 접시에 잘하고 24 h. (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C에서 품 어
   2. 인코딩 탈출 돌연변이 HA pCAGGS 플라스 미드로 0.50 µ g/잘 셀 transfect, 바이러스만 HA, 및 transfection 시 약의 사용과 야생-타입 하 passaged.
   3. (와 함께 5% CO ₂) 37 ° C에서 48 h에 대 한 6 잘 플레이트를 품 어.
   4. 48 h 후 성장 매체를 발음 하 고 부드럽게 두 번을 1 x PBS로 세척 (는 단층은 방해 하지 않아야 함).
   5. FACS 버퍼 (PBS/2% 송아지 태아 혈 청 x 1)의 500 µ L transfected 293T 세포 수확.
      참고: FACS 버퍼 미리 사용 하기 전에 4 º C에서 냉장 되어야 합니다.
   6. 4 시 5 분에 대 한 300 x g에서 수확된 293T 세포를 원심 ° c.
   7. 는 FACS 버퍼를 발음 하 고 관심 (1 ~ 5 µ g/mL의 최종 농도) mAbs를 들어 FACS 버퍼의 200 µ L로 resuspend. 20 분에 대 한 RT에서 품 어
   8. 원심 FACS 버퍼의 4 ° C. 씻어 두 번 500 µ L에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀. 유리는 펠 렛을 방해 하지로 피 펫 파스퇴르와 함께 신중 하 게 발음.
   9. 는 FACS 버퍼를 포함 하는 알 렉 사 488 (1:1, 000의 최종 희석)에 활용 된 이차 항 체의 200 µ L 함께 resuspend. 20 분에 4 ° C에서 어둠 속에서 품 어
   10. FACS 버퍼의 4 ° C. 씻어 두 번 500 µ L에서 5 분 300 g에서 세포를 원심 및 워시 버퍼를 신중 하 게 발음.
   11. 는 FACS 버퍼의 500 µ L에서 resuspend 및 바인딩 또는 polyclonal mAbs의 평가 FACS에 의해 HA와 셀 세라 페.
       참고: 실험에는 untransfected 샘플으로 서 아무 mAb/polyclonal 세라 컨트롤을 포함 하도록 하십시오.

우리가 이전 계절 인플루엔자 바이러스 백신, H7N9 예방 접종, 또는 순차적 DNA/재조합 HA 단백질 예방 접종^{4,5 에 의해 유도 된 인간과 murine mAbs에 탈출 변종 생성 하이 방법의 사용 6,7}. 위에서 설명한 항 체가 고 microneutralization 분석 실험 사용 하 여 다음^4,5을 계속 하는 특정 프로토콜의 우리에 게 먼저 특징 이었다. 항 체 07-5 D 03, 07-5F01, 07-5 G 01, 07-4B03, 07-4E02, 07-4 D 05 조류 H7N9 바이러스 (A/상하이/1/2013) (표 1)에 대 한 안녕 고 중화 활동을 발견 하 고 따라서 프로토콜 1 (2.1 단계) 이용 되었다. S6-B01 (표 1), 042-100809-2F04, 045-051310-2B06, 41-5E04 등이 활동 부족 중화와 mAbs에 대 한 프로토콜 2 (2.2 단계) 탈출 변종을 생성 하 사용 되었다. 탈출 돌연변이 매핑 밝혀 항 체의 많은 바이러스 성 하^4,5 (그림 4)에 다른 위치에서 중요 한 잔류물을 인식. 이 부정적인 항 체 줄기 지역^{4,5 탈출 점 돌연변이와 돌연변이 생성이 긍정적인 항 체의 대부분 있다 H7 하의 이전에 보고 된 항 원 사이트 근처 돌연변이 잔류물, 탈출 하는 동안} .

표 1: 항 체가 고 중화 활동의 테이블. 개인 실험 H7N9 백신 접종에서 고립 된 10 H7 전용 mAbs 전시 다른 시험관에 항 바이러스 활동⁵.

표 2: 범용 인플루엔자 바이러스 뇌관. 인플루엔자 A²⁷ B²⁸ 바이러스 및 그들의 각각 thermocycler 조건 하 세그먼트의 확대를 위한 뇌관 쌍.

그림 1: 안녕 분석 결과. 두 개의 마우스 H1 특정 mAbs 7B2 (머리 전용) 및 6F12 (스토킹 관련) 96-잘 V-하단 플레이트, 그리고 (B)는이 분석 결과²³의 결과의 예를 사용 하 여 작업을 테스트 하는 분석 결과 설정에 대 한 도식 (A) A 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: Microneutralization 분석 결과. Microneutralization 분석 결과 두 인간의 mAbs 4D 05⁵ 와 CR9114¹⁷의 활동을 테스트 설정에 대 한 도식 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 탈출 돌연변이의 발생. 제안 하는 방법론은이 항 체에 의해 전시 microneutralization 활동에 종속 됩니다. (A)에 대 한 탈출 돌연변이 생성 중화이 긍정적인 항 체 필요할 수 있습니다. 계란, 단일 통로 (B) 항 체가 부정 중화 항 체 량 증가 함께 여러 구절을 포함 수 있습니다. 세포 조직 문화입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4:는 epitope 지도 새로운 조류 H7N9 하의 탈출 돌연변이 변형 생성의 예. 백신 유발 항 체 격리 후보와 개인에서 H7N9 인플루엔자 백신 탈출 돌연변이 변종을 생성 하는 데 사용 했다. 각 찌 꺼 기는 mAb의 효율적인 바인딩에 필요한 중요 한 아미노산의 위치 빨간 나타냅니다에 표시. 데이터는 Dunand 헨리 외., 2015⁴에서 적응 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

대부분 탈출 돌연변이 통해 식별 된 잔류물의 정확 하 게 되어,이 방법의 주요 주의 사항 중 하나 이지만 탈출 이체의 점 돌연변이 의해 결정 되는 항 체의 분자 풋프린트 내에서 반드시 매핑되지 않을 수 있습니다. 구조 분석입니다. 이것은 원심 allosteric 효과 유사한 돌연변이 잔류물의 위치를 구조적 변화에 지도 하는 특정 잔류물에 돌연변이의 능력 때문 이다. 또 다른 한계는이 방법만 중화 항 체;에 대 한 구현 될 수 있습니다. 항 체를 체 외에서 선택적 압력 부족 돌연변이 탈출 이어질 것입니다. 그러나,이 제한 탈출 변종 이전 특징이 중화 항 체에 의해 생성 된 패널의 사용으로 극복할 수 있습니다. 황갈색 외. H7N9 바이러스를 중화 mAb의 탈출 변형 사용 비 중화 항 체⁷의 epitope를 지도.

그럼에도 불구 하 고, 탈출 이체의 세대를 통해 항 체의 epitopes를 elucidating 결정학 및 cryo 전자 현미경 검사 법, 둘 다 장비의 광범위 한 투자 요구에 대안을 제공 합니다. 다른 대안 mAbs 알라닌 스캔 또는 펩 티 드 스캔/자르기 돌연변이 사용 하 여 최소한의 바인딩 영역을 결정 하는. 알라닌 mutagenesis 스캔 이체의 많은 수를 생성 하는 펩 티 드 검색 하는 것은 선형 epitopes³⁰으로 제한 하는 동안²⁹, 심사 하는 동안에 작업의 상당한 금액을 요구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 아무 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하 고 사실, 사용 기존 생체 외에서 중화 분석 관심의 항 체의 탈출 이체를 생성 하도록 수정.

여러 구절 (예를 들어, 스토킹 특정 항 체)를 요구 하는 생성 탈출 변종에 대 한 프로토콜 높은 통로 0 항 체의 시작 농도에 따라 달라 집니다. 그것은 주의 측면에 잘못을 항 체의 절반 최대한 억제 농도 보다 낮은 반 로그에 로그 시작 강력한 바이러스 성장에 대 한 허용을 좋습니다. 연구원 면역 저압의 높은 titer 바이러스 문화 바이러스 인구에서 큰 유전 변이 가질 것 이라고 추측 수 있습니다. 도 이체 다음 구절에서 항 체 농도 점차적으로 증가 하 여 대 한 선택할 수 있습니다. 바이러스 성장 감소, 그 바이러스 상쾌한 양의 이전 구절에서 항 체 농도의 동일한 금액을 유지 하면서 다음 구절에서 늘릴 수 있습니다.

보편적인 인플루엔자 백신의 대부분의 목표는 HA의 스토킹 지역으로 강력한 항 체 응답을 이끌어내는 것 이다. 줄기-특정 항 체를 탈출 이체의 분석은 인플루엔자 바이러스 체력과 면역 압력 사이의 관계를 정의에서 중요 한. 흥미롭게도, 탈출 돌연변이 바이러스 스토킹 관련 mAbs에서 유래한 murine LD₅₀ 연구⁴에서 모든 감쇠 vivo에서 했다. 이러한 연구는 예방 접종 스토킹 기반 플랫폼에 대 한 강한 케이스를 제공합니다. 또한,이 프로토콜 작은 분자 억제제 같은 다른 안티 바이러스 화합물에 탈출 돌연변이 식별 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로,이 방법론 인플루엔자 바이러스 표면 glycoproteins에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 바이러스 성 glycoproteins의 epitopes를 결정 하도 더 넓게 적용 될 수 있습니다.

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); 그리고 P01AI097092-04S1 (P.E.L.)입니다.