Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Wir beschreiben eine Methode mit der identifizieren wir kritische Rückstände für die Bindung von menschlichen oder murinen monoklonalen Antikörpern, die die virale Hämagglutinin der Influenza A-Viren Zielen erforderlich. Das Protokoll kann zu anderen Virus Oberfläche Glykoproteine und ihre entsprechenden neutralisierende Antikörper angepasst werden.

Influenza-Viren zeigen eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich anzupassen und die Host-Immunantwort zu entgehen. Eine Möglichkeit ist durch Antigene auf der Oberfläche Glykoproteine des Virus auftretende Änderungen. Die Generation der Flucht Varianten ist eine leistungsfähige Methode in Aufklärung wie Viren immun entdeckt zu werden und bei der Ermittlung kritischer Rückstände für die Antikörperbindung erforderlich. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie Influenza A Virus Flucht Varianten erzeugen durch die Verwendung von menschlichen oder murinen monoklonalen Antikörper (mAbs) gegen virale Hämagglutinin (HA). Mit dem Einsatz unserer Technik gekennzeichnet wir zuvor kritische Rückstände für die Bindung von Antikörpern, die Ausrichtung der Kopf oder der Stiel des neuartigen Vogelgrippe H7N9 HA erforderlich. Das Protokoll kann leicht für andere Virus-Systeme angepasst werden. Analysen der Flucht Varianten sind wichtig für die Modellierung von Antigendrift, Bestimmung von single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) verleiht Resistenz und Virus-Fitness, und bei der Gestaltung von Impfstoffen und Therapeutika.

Ähnlich wie bei anderen RNA-Viren, Influenza A Viren besitzen eine fehleranfällige Polymerase, die für die Erzeugung einer Vielzahl von Antigenen Varianten mit jeder Runde von Replikation^1,2,3ermöglicht. Die Influenza Virus hat eine erstaunliche Fähigkeit, sich anzupassen und der menschlichen Immunantwort über Antigendrift, die durch eine Anhäufung von Mutationen auf die Oberfläche Glykoproteine erreicht wird, die zum Verlust der Antikörperbindung führt zu entziehen. Antigendrift der viralen Oberfläche Glykoproteine HA und Neuraminidase (NA), erfordert die Notwendigkeit, neu zu formulieren und den Impfstoff jährlich zu verwalten.

Technologische Fortschritte in die Isolation und die Generation der Antigen-spezifische Antikörper haben eine hohe Anzahl von Impfstoff-induzierte mAbs^4,5,6,7,8geführt. Im Gegenzug hat die Charakterisierung von Epitopen von mAbs, die im großen und ganzen Influenza A Viren neutralisieren die Entwicklung von mehreren universal Influenza-Impfstoff Kandidaten^{9,10,11unterstützt, 12,13,14}. Aufklärung des Antigenen Fußabdrucks einer MAB zeigt die strukturellen Determinanten der Neutralisation und ermöglicht eine fundierte Ansatz in Richtung Impfstoff-Design. Es ist jedoch weder realistisch noch kostengünstiger für Labors umfangreiche Panels von mAbs durch Röntgen-Kristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie strukturell zu charakterisieren, um Epitope auf virale Antigen^15, Karte ^{16 , 17 , 18}.

Röntgen-Kristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie erfordert teure Ausrüstung, spezielle Techniken und möglicherweise eine beträchtliche Menge an Zeit, um Daten zu generieren. Ein alternativer und schneller Ansatz nutzt die schnelle Generierung von verschiedenen viralen Bevölkerungsgruppen über die fehleranfällige RNA-abhängige RNA-Polymerase, Escape-Mutanten um festzustellen, die Epitope von mAbs^{19,20, generieren 21,22,23}. Die Generation der Flucht Varianten erfordert spezielle Ausrüstung oder Technik und kann mit herkömmlichen Laborreagenzien und Ausrüstung durchgeführt werden.

Hier beschreiben wir eine Methode, die für die Zuordnung von kritischen Rückstände erforderlich für mAb Bindung ermöglicht, die die Influenza HA erkennen.

Achtung: eine Reihe von Influenza-Viren im Umlauf in der menschlichen Bevölkerung (z. B. H1, H3) sind Biosafety Level 2 Klasse Krankheitserreger, die mit Sorgfalt und geeignete persönliche Schutzausrüstung behandelt werden müssen. Umgang mit Viren muss von der Institutional Review Board genehmigt werden. Das folgende Protokoll wurde von der Institutional Review Board am Berg Sinai genehmigt.

Hinweis: HA-spezifische Antikörper, die virale Replikation hemmen können in der Regel in i) diejenigen, die an bzw. nahe der Rezeptor-Bindungsstelle auf dem kugelförmigen Kopf binden und Ii), die distal der Rezeptorbindung binden kategorisiert Domäne, die der lateralen Seite der kugelförmigen Kopf und Stiel Region des HA umfasst. Antikörper, die auf die Rezeptor-Bindungsstelle zu verhindern, dass das Engagement der Sialinsäure Säure Motive auf der Oberfläche der Zielzellen und verwenden einen Hämagglutination Inhibition (HI) Assay gemessen werden können. Antikörper, die HI-negativ sind wie Stiel-spezifische Antikörper, virale Replikation noch hemmen können, sondern nur mit Neutralisierung Assays beurteilt werden können.

1. Kategorisierung Antikörper anhand HI und Neutralisation Aktivitäten

1. HI-Assay
   1. In eine 96-Well-V-Boden-Platte hinzufügen 25 µL 1 X PBS auf Spalten 2 bis 12.
   2. Verdünnen der mAb 7B2 (Kopf-spezifisch), 6F12 (Stiel-spezifisch) ²³ und ein Isotype Steuerelement bis 100 µg/mL in 1 x PBS und aliquoten 50 µL der verdünnten Antikörper-Vorbereitungen in Spalte 1. Auch eine keine mAb-Kontrolle durch Zugabe von 50 µL 1 X PBS ( Abbildung 1A).
   3. 2-fold serielle Verdünnungen der Antikörper durch Übertragung von 25 µL von Spalte 1, Spalte 2 durchführen, und so weiter. Entsorgen Sie die letzten 25 µL aus Spalte 12 ( Abbildung 1A).
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass eine Reihe von keine Antikörper-Kontrolle.
   4. Verdünnen den Virus bestand (ein Reassortant Virus Ausdruck der HA und NA der A/California/04/09 mit den internen Segmenten des A/Puerto Rico/8/34) 8 Hämagglutination Einheiten/25 µL verdünnt Virus bestand. Hinzufügen von 25 µL der verdünnten Virus bestand (8 Hämagglutination) in jede Vertiefung (Zeilen A bis G).
      Hinweis: Die Antikörper und Virus-Gemisch muss einem Endvolumen von 50 µL mit einem Start Endkonzentration von 50 µg/mL.
   5. Inkubation der Platte bei Raumtemperatur (RT) für 45 min.
   6. Für den Rücken-Titration Reihe (H), hinzufügen 50 µL 1 X PBS auf Brunnen H2 H12. Fügen Sie 100 µL 8 Hämagglutination Einheiten/25 µL H1 gut. Seriell verdünnen zweifach durch die Übertragung von 50 µL von H1, H2, und so weiter. Entsorgen Sie die letzten 50 µL aus gut H12. Schließlich fügen Sie 50 µL 0,5 % Huhn Erythrozyten (RBC) in alle Vertiefungen der 96-Well-V-Boden-Platte.
      Hinweis: Sollte die mAb-Proben im Test haben ein Endvolumen von 100 µL: mAb (25 µL), Viren (25 µL) und RBC (50 µL). Der letzte Band der keine mAb-Kontrolle sollte 25 µL 1 x PBS, 25 µL des Virus und 50 µL der RBC enthalten.
   7. Inkubation der Platte bei 4 ° C für 1 h.
   8. Lesen optisch die Platten für HI-Aktivität. Gibt es eine positive Anzeige für einen bestimmten Antikörper, fahren Sie mit Schritt 2.1 Flucht Varianten erzeugen. Wenn der Antikörper HI negativ ist, fahren Sie unten mit Schritt 1.2 zu beurteilen, ob der Antikörper hat neutralisierende Aktivität in eine Zelle-Kultur-Assay.
      Hinweis: Eine positive Auslesen eines HI-aktiv-MAB wird durch ein dunkles Rot RBC Pellet in der Mitte eines Brunnens ( Abb. 1 b 7B2), die eine Träne bilden wird, wenn die 96-Well-V-Boden-Platte in einem Winkel von 45° gehalten wird. Eine negative Auslese bilden keinen dunkle rote RBC Pellet im Brunnen ( Abbildung 1 b 6F12 und keine mAb). Isotype Kontrolle bilden auch keinen dunklen roten RBC Pellet und sollte aussehen identisch mit Stiel-spezifischen Antikörper, 6F12 oder die keine mAb kontrollieren Probe ( Abbildung 1 b) ²³.
2. Microneutralization Test
   1. Platte Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 ⁴ Zellen/Brunnen in einer Gewebekultur 96-Well-Platte behandelt und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO ₂ für 17 bis 19 Uhr .
      Hinweis: Die Zellen können auch an der Unterseite des Brunnens für ein Minimum von 4 h vor Gebrauch halten erlaubt.
   2. In einem separaten 96-Well-Platte führen sieben 3-fold serielle Verdünnungen der menschlichen MAB 4D 05 ⁵, CR9114 ¹⁷ oder Isotype IgG-Kontrolle, bei Start Konzentration von 200 µg/mL in 1 X minimaler wesentliches Medium (MEM) mit Tosyl ergänzt Phenylalanyl Chloromethyl Keton (TPCK)-Trypsin (1 µg/mL) behandelt ( Abbildung 2).
      Hinweis: Reihe A sollte 75 µL verdünnter Antikörper (ab Konzentration von 200 µg/mL) enthalten. Seriell (3-fach) verdünnen Sie die Platte durch die Übertragung von 25 µL von Reihe A, Reihe B, und so weiter. Zeilen A bis H müssen einem Endvolumen von 50 µL. Gibt es keine Spitzenwechsel zwischen Verdünnung Transfers.
   3. Verdünnen den Virus bestand (Reassortant-Virus mit dem Ausdruck der HA und NA der A/Shanghai/1/13 mit dem internen Segment des A/Puerto Rico/8/34), einen 100 50 % Gewebekultur infektiöse Dosis (TCID ₅₀) / 50 µL in 1 X MEM ergänzt mit TPCK behandelt Trypsin (1 µg/mL) ²⁴. Die Antikörper-Präparate (Schritt 1.2.2) 50 µL/Well des verdünnten Virus hinzufügen. Die nicht infizierten Zelle Kontroll-Vertiefungen 50 µL 1 X MEM hinzufügen.
   4. Brüten die Virus-Antikörper-Mischungen in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂) für 1 h
      Hinweis: Sollte die Virus-Antikörper-Mischungen haben ein Gesamtvolumen von 100 µL: 50 µL Antikörper Verdünnung (Schritt 1.1.2) und 50 µL des Virus, enthält 100 TCID ₅₀ (Schritt 1.2.3).
   5. Aspirieren Sie die Medien in den Vertiefungen und fügen Sie die gesamten 100 µL der Virus-Antikörper-Mischungen in entsprechenden Vertiefungen.
      Hinweis: Die Absaugung erfolgt über einen 8-Kanal-Sauger Adapter an ein Vakuum angeschlossen. Alternativ kann eine 8 oder 12-Well Multichannel-Mikro-Pipette verwendet werden, um manuell Aspirieren. Alle Aspiration während der Inokulum Weg- oder Waschungen erfolgt durch die höchste Konzentration des Antikörpers auf den niedrigsten, ohne die Notwendigkeit zu ändern Tipps.
   6. Waschen der Monolage mit 200 µL 1 X PBS. Aspirieren Sie 200 µL 1 X PBS (wie in Schritt 1.2.5). Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
   7. Infizieren die Monolayer MDCK-Zellen durch das Hinzufügen der gesamten 100 µL/Well von Virus-Antikörper-Mischungen (aus Schritt 1.2.4) auf der Monolage und infizieren/Inkubation bei 37 ° C (mit 5 % CO ₂) für 1 h.
   8. Während der Infektion in eine separate 96-Well-Platte, bereiten Sie eine weitere Reihe von Antikörper-Verdünnungen. Fügen Sie 150 µL 100 µg/mL des jeweiligen Antikörpers in der Zeile A und 100 µL 1 x MEM ergänzt mit TPCK behandelt Trypsin (1 µg/mL) in Zeilen B H. Perform 3-fold Verdünnungen durch Übertragung von 50 µL von Reihe A, Reihe B , und so weiter, bis Zeile H. verwerfen die letzten 50 µL aus Zeile H. Das Gesamtvolumen für jeden gut sollte gleich 100 µL. beiseite.
      Hinweis: Die Antikörper werden in 1 X MEM mit TPCK behandelt Trypsin (1 µg/mL ergänzt) verdünnt.
   9. Das Virus-Antikörper-Inokulum aus der Monolage im Schritt 1.2.7 Aspirieren und Auffüllen mit der gesamten 100 µL/Well der entsprechenden Antikörper Verdünnung in Schritt 1.2.8 vorbereitet.
      Hinweis: Wenn ein gut enthaltenen eine endgültige Antikörperkonzentration von 100 µg/mL während der Infektion (Schritt 1.2.7), dann die ergänzende Medien sollte auch eine endgültige Antikörperkonzentration von 100 µg/mL (Schritt 1.2.8).
   10. Inkubation für 24 h in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂).
   11. Aspirieren Sie die Medien aus der 96-Well-Platten und dreimal mit 200 µL/Well 1 X PBS waschen.
   12. Befestigen Sie die Zellen mit 100 µL kalt 80 % Aceton für 1 h bei-20 ° c
       Hinweis: Die 80 % Aceton-Lösung wird doppelt destilliertem (Dd) H ₂ O (z.B., 80 mL 100 % Aceton plus 20 mL DdH ₂ 0) verdünnt. Die 80 % Aceton-Lösung auf dem Eis vor Gebrauch gekühlt werden kann.
   13. Der Zellen mit 200 µL/Well 1 X PBS dreimal waschen.
   14. Block die Platten mit 200 µL/Well 5 % Milch verdünnt mit 1 X PBS-Puffer und inkubieren Sie Platten bei RT für 1 h.
   15. Hinzufügen 100 µL biotinylierte Anti-Grippe eine Nucleoprotein (NP) Primärantikörper verdünnt 1:2,000 1 x PBS/1% Rinderserumalbumin (BSA) und inkubieren Sie Platten bei RT für 1 h
       Hinweis: Für Influenza B-Viren, ein Influenza-B-Virus-spezifischen Anti-NP Antikörper eingesetzt werden.
   16. Die Platten mit 1 X PBS dreimal waschen.
   17. Streptavidin - Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugierte Antikörper hinzufügen 100 µL verdünnt 1:3,000 1 x PBS/1% BSA und inkubieren Sie die Platten bei RT für 1 h.
   18. Die Platten mit 200 µL 1 X PBS dreimal waschen.
   19. HRP Substrat Reagenz bei 100 µL/Well und inkubieren Sie im Dunkeln bei RT
       Hinweis: Die Inkubationszeit sollte vor der Zugabe des Puffers sauren stoppen (siehe unten) optimiert werden. In der Regel 15 bis 30 min. reicht.
   20. Stillen die Reaktion mit 50 µL/Well von 5 M HCl.
       Achtung: 5M HCl ist eine stark ätzende Reagenz, die Augen, Haut und Schleimhäute schädigen kann. Zugabe von diesem Reagens getan werden sollte, unter einem gelüftete Haube mit geeignete persönliche Schutzausrüstungen.
   21. Lesen Sie die Platten bei 492 nm und subtrahieren Sie die Hintergrund (nicht infizierte Zellen) Brunnen.
   22. Die prozentuale Hemmung mit folgender Formel berechnen:
       
   23. Wenn ein Antikörper Neutralisation Aktivität (und keine HI-Aktivität), gehen Sie zu Schritt 2.2 hat.
       Hinweis: Antikörper, die in-vitro- Neutralisation Aktivität fehlt HI Aktivität fehlen werden.

2. Generation von Escape Mutant Varianten

Hinweis: neutralisierende Antikörper, die haben oder fehlt HI Aktivität sind weiter mit den unten beschriebenen Protokolle analysiert.

1. Protokoll 1: HI-positiv/Neutralisation-Positive Antikörper ( Abbildung 3A ()
   1. bereiten einen Virus bestand von 10 ⁶ Plaque bilden Einheiten/ml (PFU/mL) mit 1 X PBS-Puffer in ein Volumen von 400 µL.
   2. Bereiten Sie vier Verdünnungen des Antikörpers von Interesse in steigenden Konzentrationen (z.B. 0, 0.5, 0.05 und 0,005 mg/mL) mit 1 X PBS-Puffer in einem Volumen von 100 µL pro Verdünnung.
      Hinweis: Wildtyp Virus sollte immer parallel und in Ermangelung des Antikörpers passagiert werden. Die Sequenzen dieser passaged Viren hilft bei der Unterscheidung zwischen Anpassung zu Zelle Kulturbedingungen und Mutationen zu entkommen.
   3. Mix 100 µL 10 ⁶ PFU/mL des Virus mit 100 µL jeder Antikörper-Verdünnung oder 100 µL 1 X PBS.
   4. Inkubation für 1 h in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂). Vortex kurz. Injizieren von 200 µL jeder Mischung in spezifischen Erreger frei (SPF) embryonierten Hühnereiern.
   5. Inkubieren Sie die Eizellen bei 37 ° C (ohne CO ₂) für 40-44 h.
   6. Opfern der Virus infiziert embryonierten Eiern durch Inkubation bei 4 ° C für mindestens 6 h.
   7. Ernten die Viruswenig Flüssigkeit aus den Eiern, wie zuvor beschrieben ^{24 , 25}.
   8. Führen die Hämagglutination Assay, wie über ^{24 , 26} beschrieben. Wenn alle Viruswenig Fluid Vorbereitungen Hämagglutination Titer nicht verfügen, wiederholen Sie ab Schritt 2 mit Antikörper-Verdünnungen von 0,005 mg/mL bis hin zu 0,00005 mg/mL.
      Hinweis: Eine Sättigung Konzentration von einem HI-Positive Antikörper kann alle vorliegenden Viruspartikel neutralisieren. Daher, es kann erforderlich sein, die Menge des Antikörpers in die Passagierung vorhanden zu verringern.
   9. Bestätigen die Flucht-Varianten durch Ausführen der HI assay ²⁴ (Schritt 1.1).
      Hinweis: HI-aktive Antikörper blockieren HA Engagement von Sialinsäure Säure Motiven auf den Zielzellen. Daher verliert ein Virus im Beisein von seinem Verwandten Antikörper die Fähigkeit zu Erythrozyten (Vorhandensein von RBC Pellet) verbinden. Theoretisch Flucht Varianten des HI-aktive Antikörper noch Sialinsäure Säure Motive auch in Gegenwart von seinem Verwandten Antikörper binden können und somit können Erythrozyten (keine RBC Pellet) verbinden. Wenn der HI des Antikörpers von Interesse noch nachweisbar ist, wiederholen Sie das Protokoll aus Schritt 2.1.2 mit einer höheren ab Konzentration des Antikörpers.
2. Protokoll Nr. 2: HI-negativ/Neutralisation-Positive Antikörper ( Abbildung 3 b ()
   Hinweis: um Flucht Varianten gegen neutralisierenden Antikörpern, die HI fehlt zu generieren Aktivität, das Virus muss in der Gegenwart immer größere Mengen von Antikörpern passagiert.
   1. Platte MDCK-Zellen in einem 6-Well-Platte bei einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen/gut und inkubieren Sie für ein Minimum von 4 h in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂).
   2. Verdünnen den Virus bestand bis 10 ⁶ PFU/mL oder das Virus vom vorherigen Durchgang in 1 x MEM mit TPCK behandelt Trypsin (1 µg/mL) in einem Volumen von 500 µL.
   3. Vorbereitung eine einzige Verdünnung der Antikörper (0,02 mg/mL für den ursprünglichen Durchgang oder höher für alle folgenden Passagen) in 1 x MEM mit TPCK behandelt Trypsin in einem Volumen von 250 µL.
   4. Mix 250 µL verdünnter Virus mit 250 µL verdünnter Antikörper (+ Antikörper) oder 250 µL 1 x MEM (keine Antikörper-Kontrolle).
   5. Brüten die Virus-Antikörper-Mischung für 30 min in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂).
   6. Absaugen die Medien mit einem Glas Pasteur pipette und Waschen der Monolage von Zellen mit 1 mL 1 X PBS.
   7. Fügen Sie 500 µL der Mischungen in die Vertiefungen und brüten in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂) für 1 h.
   8. Nach 1 h, ergänzen die Brunnen mit 2 mL 1 x MEM mit TPCK behandelt Trypsin (1 µg/mL).
   9. Überprüfen Sie die Zellen in 48 h nach der Infektion auf Anzeichen von zytopathischer Effekt (CPE) am Mikroskop oder führen Sie einen Hämagglutination Assay zur Erkennung von viralen Wachstums ²⁶.
   10. In den Kulturen ergänzt mit Antikörper gibt es grobe CPE, Ernte den Überstand in mehreren Cryo-Röhrchen, Label mit dem Passagenanzahl und Store bei-80 ° c
   11. Sparen 100 µL des Überstands, eine frische Monolage von MDCKs mit 2 mL 1 X infizieren ergänzt MEM mit TPCK-Trypsin und Antikörper. Denken Sie daran, eine keine Antikörper-Kontrolle für jede Passage enthalten.
       Hinweis: Erhöhen Sie die Konzentration des Antikörpers von zwei-Fach (oder nach dem Ermessen des Forschers) in den nächsten Durchgang (alle zwei Tage).
   12. Erhöhen die Konzentration des Antikörpers in jeder aufeinander folgende Passage bis Virus Wachstum auch mit einer Endkonzentration von 0,6 mg/mL des Antikörpers noch voll funktionsfähig ist. Einfrieren der mehrere Fläschchen Überstand der einzelnen Durchgang und Lagern bei-80 ° c
       Hinweis: Keine Antikörper-Kontrolle ist entscheidend für das Wachstum des Virus von einer Stelle zur anderen zu überprüfen. Wenn gibt es grobe CPE keine Antikörper-Kontrolle, aber kein CPE in der + Antikörper-Gruppe, dies bedeutet, dass die Konzentration des Antikörpers zu hoch war und kein entkommen-Varianten generiert wurden. Wenn es Brutto CPE in keine Antikörper-Kontrolle, aber nur moderate CPE in der + Antikörper-Gruppe, dies zeigt das Vorhandensein von möglichen Flucht-Varianten. In der nächsten Passage, erhöhen Sie die Lautstärke der Durchgang zu 200 µL des Überstandes und pflegen die Konzentration der Antikörper erhöht die Wahrscheinlichkeit der Flucht Variantenbildung.

3. Isolierung der Flucht Varianten durch Plaque Reinigung

1. Platte MDCK-Zellen in einem 6-Well-Platte bei einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen/gut und inkubieren Sie für ein Minimum von 4 h in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂).
2. Verdünnen die Antikörper in 1 x MEM mit TPCK behandelt Trypsin 300 µg/mL in einem Volumen von 250 µL und Mix mit 250 µL des entsprechenden Flucht mutierten Virus ab. Virus in der Abwesenheit des Antikörpers passagiert sollte auch Plaque gereinigt.
3. Aspirieren Sie die Medien aus den Zellen, dreimal mit 1 X PBS waschen und fügen Sie die gesamten 500 µL der Virus-Antikörper-Mischung (Schritt 3.2).
4. Inkubieren Sie die Platten für 1 h in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂) und achten Sie auf alle 10 Minuten um zu verhindern, Trocknung von der Monolage hin und her schaukeln.
5. Aspirieren Sie die Virus-Antikörper-Mischungen und ergänzen die Brunnen mit Overlay-Agar-Medien, die entsprechende Mengen von Antikörpern (300 µg/mL; Schritt 3.2).
6. Inkubieren Sie die Platte für 40-44 h in einem Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂).
7. Kreis die sichtbaren Plaques mit einem blau oder schwarz gefärbten Marker Plaque Kommissionierung zu erleichtern.
8. Pick vier Gedenktafeln für jede zu entkommen, mutierten Virus-Antikörper-Kombination sowie Wildtyp Viren, die in MDCK-Zellen oder Eiern in der Abwesenheit des Antikörpers passagiert wurden.
9. Aufschwemmen der Plaque in 100 µL 1 X PBS.
10. Injizieren die gesamten 100 µL Plaque gereinigten Flucht mutierten Virus in 10 - Tage alten SPF embryonierten Hühnereiern.
11. Brüten die Eizellen für 40-44 h in einem Inkubator 37 ° C (ohne 5 % CO ₂).
12. Führen eine Hämagglutination Test bestätigen das Vorhandensein von Viren (Schritt 1.1).

4. Gewinnung von viralen RNA und Analyse von HA-Sequenz Variation

1. Auszug der viralen RNA aus 200 µL der Flucht mutierten Virus Viruswenig Flüssigkeit mit einer Mono-phasisch Lösung aus Phenol und Guanidin erfolgt.
   Achtung: Phenol ist ein flüchtige flüssige Reagenz, die verursachen Husten, Atemnot und mäßig Hautreizungen durch Kontakt kann.
2. Verstärken die HA-Segment von der viralen RNA mit dem Einsatz von einem Reverse-Transkriptase und Gen-spezifische Primer für die Influenza A HA segment ²⁷.
   Hinweis: Die universal Primer für Influenza B-Viren, die in Tabelle 2 beschriebenen verstärken beide HA (~ 1.800 bp) und NA (~ 1.500 bp) ²⁸.
3. Lösen die RT-PCR-Produkt in einem 1 % Agarosegel und die richtig dimensionierte Band Ausschneiden (~ 1.800 bp).
4. Gel-Extrakt das PCR-Produkt mit einer Silica-Membran-basierten Reinigungsprozedur und senden die cDNA für Sequenzierung.
5. Identifizieren der Aminosäurerest für die Antikörperbindung durch Differenzierung der Mutationen auf vermeintliche Flucht Varianten gefunden und Wildtyp Virus aufgrund der Zelle Kultur Anpassung oder immunologische Auswahl passagiert.
6. Klonen das PCR-Produkt mit dem Wildtyp oder Variante HA zu entgehen, in einen pCAGGs Ausdruck Vektor (NotI und NheI).
7. Bindung des Antikörpers an die Flucht Variante HA mit zwei Möglichkeiten (oder beides) unten beschriebenen beurteilt werden kann.

5. Antikörper binden Analysen der Flucht Varianten

1. Immunfluoreszenz
   1. Platte 293T Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 ⁴ Zellen/Brunnen in einer 96-Well-Platte und in den Inkubator 37 ° C (mit 5 % CO ₂) für 24 h inkubieren.
   2. Transfect Zellen mit 0,10 µg/Brunnen der Codierung der Flucht Mutante HA pCAGGS Plasmide, Virus passagiert HA und Wildtyp HA (unpassaged) mit dem Einsatz von Transfection Reagens.
   3. 96-Well-Platten für 48 h bei 37 ° C Inkubator (mit 5 % CO ₂) inkubieren.
   4. Fix mit 100 µL 0,5 % Paraformaldehyd für 15 min bei RT
      Achtung: Paraformaldehyd ist eine flüchtige flüssige Reagenz, das kann zu Husten, Kurzatmigkeit und mäßig Hautreizungen durch Kontakt. Es wurde als ein möglicher menschliches Karzinogen ausgewiesen. Zugabe des Reagenz sollte in einem gelüfteten chemische Abzug erfolgen.
   5. Waschen mit PBS 1 x drei Mal. Block mit 5 % Milch mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei RT
   6. Mit 1 X PBS dreimal waschen. Mit 5 µg/mL des Antikörpers von Interesse für 1 h bei RT inkubieren
   7. Mit 100 µL der sekundäre Antikörper (Anti-Human oder Anti-Maus Alexa 488) zu einer Verwässerung des 1:2,000 1 x PBS/1% BSA für 1 h bei RT im Dunkeln inkubieren.
   8. Mit 1 X PBS dreimal waschen. Beobachten Sie die Zellen auf einem fluoreszierenden Mikroskop für positive oder negative Färbung.
2. Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS)
   1. Platte 293T Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 ⁵ Zellen/Brunnen in einem 6-Well-Platte und Inkubation bei 37 ° C (mit 5 % CO ₂) für 24 h.
   2. Transfect Zellen mit 0,50 µg/Brunnen mit pCAGGS-Plasmide, die Codierung der Flucht Mutante HA, Virus passagiert nur HA und Wildtyp HA mit dem Einsatz von Transfection Reagens.
   3. 6-Well-Platten für 48 h bei 37 ° C (mit 5 % CO ₂) inkubieren.
   4. Nach 48 h aspirieren Sie die Wachstumsmedien und mit 1 X PBS zwei mal vorsichtig waschen (darauf achten, dass der Monolage ungestört).
   5. Ernte transfizierten 293T Zellen mit 500 µL FACS-Puffer (1 x PBS/2% fetalen Kälberserum).
      Hinweis: FACS Puffer sollte bei 4 º c vor Gebrauch vorgekühlt.
   6. Zentrifugieren der geernteten 293T Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° c
   7. Aspirieren den FACS-Puffer und Aufschwemmen mit 200 µL des FACS-Puffer mit mAbs von Interesse (Endkonzentration von 1 bis 5 µg/mL). 20 min. bei RT inkubieren
   8. Zentrifugieren der Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° c waschen zweimal mit 500 µL der FACS-Puffer. Aspirieren Sie sorgfältig mit einem Glas Pasteurpipette, nicht stören das Pellet.
   9. Aufschwemmen mit 200 µL des FACS-Puffer mit Sekundärantikörpers konjugiert, Alexa 488 (Endverdünnung von 1:1 000). Inkubieren Sie im Dunkeln bei 4 ° C für 20 min.
   10. Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° c waschen zweimal mit 500 µL der FACS-Puffer und aspirieren Sie sorgfältig die Waschpuffer.
   11. In 500 µL Puffer FACS Aufschwemmen und Bindung von mAbs und/oder polyklonalen zu beurteilen seren Zellen mit HA durch FACS transfiziert.
       Hinweis: Denken Sie daran, eine keine mAb/polyklonalen Seren-Kontrolle sowie eine untransfected Probe in das Experiment.

Wir haben zuvor Variationen dieser Methode benutzt, um Flucht Varianten zu menschlichen und murinen mAbs induziert durch die saisonale Influenza-Virus-Impfstoff, H7N9 Impfung oder sequenzielle DNA/rekombinante HA Protein Impfung^{4,5 generieren ,6,7}. Wie oben beschrieben, wurden Antikörper zuerst mit der HI und Microneutralization Assays um mitteilen, welche spezifischen Protokolls weiterhin mit nächsten^4,5charakterisiert. Antikörpern 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 und 07-4D 05, HI und Neutralisierung Aktivitäten gegen die Vogelgrippe H7N9-Virus (A/Shanghai/1/2013) (Tabelle 1) gefunden wurden, und so Protokoll 1 (Schritt 2.1) genutzt wurde. Für mAbs mit neutralisieren, dass HI-Aktivität, z. B. 41-5E04, 045-051310-2B06, 042 100809 2F04 und S6-B01 (Tabelle 1) der Mangel, wurde Protokoll Nr. 2 (Schritt 2.2) zur Flucht Varianten erzeugen. Flucht mutierten Zuordnung ergab, dass viele der Antikörper kritischer Rückstände an unterschiedlichen Standorten auf die virale HA^4,5 (Abbildung 4 erkennen). Während die Mehrheit der HI-Positive Antikörper haben mutierten Rückstände in der Nähe von bereits gemeldeten Antigenen Stätten der H7 HA flüchten, generiert die HI-Negative Antikörper Escape-Mutanten mit Punktmutationen im Stiel Region^4,5 .

Tabelle 1: Tabelle HI und Neutralisierung Antikörperaktivität. 10 H7-spezifische mAbs isoliert von Individuen mit einer experimentellen H7N9-Impfstoff Geimpften weisen verschiedene in-Vitro antivirale Aktivitäten⁵.

Tabelle 2: Universal Influenza Virus Zündkapseln. Grundierung-Paare für die Verstärkung der HA-Segmente von Influenza-A-²⁷ und B²⁸ Viren und ihre jeweiligen Thermocycler-Bedingungen.

Abbildung 1: HI-Assay. (A) A Schaltplan für die Einrichtung eines HI-Assays, die Aktivität der beiden Maus H1-spezifische mAbs 7B2 (Kopf-spezifisch) und 6F12 (Stiel-spezifisch) mit einer 96-Well-V-Boden-Platte, und (B) ein Beispiel für die Ergebnisse von einer HI-Assay-²³zu testen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Microneutralization Assay. Ein Schaltplan für die Einrichtung eines Microneutralization-Assays, die Aktivität von zwei menschlichen mAbs 4 05⁵ und CR9114¹⁷zu testen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Generation von Escape-Mutanten. Die Methodik vorgeschlagen werden abhängig von der HI und die Microneutralization-Aktivität durch die Antikörper ausgestellt. Die Generation der Escape-Mutanten gegen(a-)erfordern neutralisierende HI-Positive Antikörper einen Durchgang in den Eiern, während neutralisierende HI-Negative Antikörper (B) mehrere Passagen mit steigenden Mengen Antikörper in beinhalten kann Zelle-Gewebe-Kultur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Beispiel für ein Epitop-Map des neuartigen Vogelgrippe H7N9 HA mit Flucht mutierten Varianten generiert. Impfstoff-induzierte Antikörper isoliert von Individuen mit einem Kandidaten geimpft H7N9 Grippe ein Impfstoff wurden zur Flucht mutierten Varianten erzeugen. Jede Rückstände in Rot repräsentiert die Position des kritischen Aminosäuren benötigt für effiziente Bindung einer MAB angegeben. Daten wurden von Dunand-Henry Et Al., 2015⁴angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Obwohl die Mehrheit der Rückstände über Escape-Mutanten identifiziert präzise gewesen, ist eines der großen Vorbehalte dieses Ansatzes, dass Punktmutationen Flucht Varianten innerhalb der molekularen Ausleuchtzone des Antikörpers bestimmt nicht unbedingt zuordnen kann Strukturanalysen. Dies ist aufgrund der Fähigkeit einer Mutation an einen gewissen Rückstand zu einer Konformationsänderung distal an die Stelle des mutierten Rückstands, analog zu einer allosterischen Effekt führen. Eine weitere Einschränkung ist, dass diese Methode nur für neutralisierenden Antikörpern umgesetzt werden kann; Antikörper, die in-vitro- selektiven Druck fehlt führt nicht um durch Mutation entstehende Variationen zu entkommen. Diese Einschränkung kann jedoch mit dem Einsatz von einem Gremium von Flucht-Varianten von bisher charakterisierten neutralisierende Antikörper erzeugt überwunden werden. Tan Et Al. verwendet eine Flucht-Variante eine neutralisierende MAB mit dem H7N9-Virus, das Epitop eines nicht neutralisierende Antikörper⁷zuzuordnen.

Dennoch bietet die Aufklärung die Epitope von Antikörpern durch die Generierung von Flucht Varianten eine echte Alternative zur Kristallographie und Cryo-Elektron Mikroskopie, beide mit eine umfangreichen Investition von Ausrüstung erfordern. Andere Alternativen sind die minimale Bindung Region mAbs mit Alanin scannen oder Peptid Scannen/Trunkierung Mutanten zu bestimmen. Alanin Scannen Mutagenese erfordern eine erhebliche Menge an Arbeit bei der Erzeugung einer Vielzahl von Varianten bei²⁹, screening, während Peptid Scannen auf lineare Epitope³⁰begrenzt ist. In diesem Protokoll beschriebene Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Technik und in der Tat nutzt bestehende in-vitro- Neutralisation Assays geändert, um Flucht Varianten der Antikörper von Interesse zu erzeugen.

Das Protokoll zur Generierung von Flucht-Varianten, die mehrere Passagen (z.B., Stiel-spezifische Antikörper) erfordern ist stark abhängig von der Ausgangspunkt Konzentration des Antikörpers in Abschnitt 0. Es ist besser, irren auf der Seite der Vorsicht und beginnen bei einem Protokoll um die Hälfte niedriger als die halbe maximale hemmende Konzentration eines Antikörpers ein Protokoll und robuste Virus Wachstum ermöglichen. Der Forscher spekulieren, dass eine hoher Titer Virus Kultur im Beisein von immunologischen Niederdruck eine große genetische Variation in der viralen Population haben wird. Flucht-Varianten können durch die schrittweise Erhöhung der Antikörperkonzentration in den folgenden Passagen für ausgewählt werden. Den Fall, dass das Virus Wachstum sinkt, kann die virale Überstand in den nächsten Durchgang erhöht werden und gleichzeitig die gleiche Menge an Antikörperkonzentration im vorherigen Durchgang.

Ein Großteil der universal Influenza-Impfstoffe soll eine robuste Antikörperantwort gegenüber der Stiel-Region des HA zu entlocken. Die Analysen der Flucht Varianten an Stiel-spezifische Antikörper sind wichtig bei der Definition der Beziehung zwischen Influenza Virus Fitness und immunologische Druck. Interessanterweise waren Flucht mutierte Viren aus Stiel-spezifische mAbs alle abgeschwächte in Vivo in murinen LD₅₀ Studien⁴. Diese Studien liefern ein starkes Argument für die Impfung Stiel-basierte Plattformen. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll verwendet werden, um Escape-Mutanten auf andere antiviralen Verbindungen, wie z. B. niedermolekularer Hemmer zu identifizieren. Zu guter Letzt diese Methode beschränkt sich nicht auf Influenza Virus Oberfläche Glykoproteine, aber auch häufiger angewandt werden um die Epitope von anderen viralen Glykoproteinen zu bestimmen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Projekt wurde teilweise mit Bundesmitteln aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases finanziert, National Institutes of Health, Department of Health And Human Services, unter CEIRS Vertrag HHSN272201400008C (F.K.); NIH-U19AI109946-01 (F.K.); und P01AI097092-04S1 (P.E.L.).