테스트를위한 병아리 심장 침략 분석 암 세포의 침윤과 잠재적 안티 침략 화합물의 활동

여기서는 입체적 정상 조직 절편에 살아있는 종양 세포의 침윤을 연구 프로토콜을 제시한다. 이 기관 배양 기술은 주로 시험 관내에서 잠재적으로 항 - 침습 약물을 시험에 적용된다.

병아리 심장 분석의 목적은 입체적 종양 침윤을 연구하는 중요한 장기 배양 방법을 제공하는 것이다. 분석은 침습적 및 비 침습적 세포를 구별하고, 종양 침윤에 대한 시험 화합물의 효과에 대한 연구를 가능하게 할 수있다. 암 세포 - 중 집계 또는 단일 세포로 - 배아 병아리 마음의 조각에 직면하고 있습니다. 며칠 또는 몇 주 동안 정지에서 기관 배양 후 직면 문화는 고정 및 조직 학적 분석을 위해 파라핀에 포함. 암세포 및 정상 조직 사이의 입체적인 상호 작용은 다음 헤 마톡 실린 - 에오신으로 또는 심장 조직의 에피토프 또는 대향하는 암 세포에 대한 면역 조직 화학 염색을 한 후 염색 직렬 섹션에서 재구성된다. 분석은 암세포 침윤이 암세포 및 그들의 이웃 기질 호스트 소자 (근육 섬유 모세포, endoth 분자 사이의 상호 작용의 결과 인 것으로 최근의 개념과 일치elial 세포, 세포 외 매트릭스 성분 등). 여기서,이 기질은 환경 생체 조직 절편 같은 암세포에 제공된다. 분석의 관련성에 대한 지원은 여러 양태이다. 프로그레시브 직업 및 교체 시간과 숙주 조직의 공간 및 침입과 대향 세포의 생체 내에서 비 - 침입 일반적 분석의 결과와 상관 관계 : 분석에서 내습 암 침윤의 기준에 따른다. 또한, 생체 내에서 세포의 침입 패턴은 병리학 자에 의해 정의 된 바와 같이, 분석에서 조직 학적 이미지에 반영된다. 많은 잠재적으로 항 - 침습 유기 동족체 화합물과 얻어진 결과의 정량 구조 - 활성 관계 (QSAR) 분석은 임상에서 사용되는 플라보노이드 및 칼콘, 공지 된 항 - 전이성 약물 구조 - 활성 관계 (예를 들어, 미세 소관 억제제의 연구를 허용 )뿐만 아니라 분석에서 침입을 억제한다. HoweveR, 분석은 암 침공 계정 면역 학적 기여를 고려하지 않습니다.

침략은 악성 종양의 특징이다. 이 활동은 주변 조직의 파괴에 이르게뿐만 아니라 전이 형성에 연루되어 아닙니다. 암 환자가 침윤 및 전이, 효율적인 안티 침습적 치료법으로 사망 때문에 여전히 종양 세포의 침윤이 개발되었다 모방 부족한 실험실 분석이다. 병아리 심장 분석의 목적은 입체적 종양 침윤을 연구하는 중요한 장기 배양 방법을 제공하는 것이다. 분석은 침습적 및 비 침습적 세포를 구별하고, 종양 침윤에 대한 시험 화합물의 효과를 연구 할 수있다.

분석의 사용 배후의 이론적 근거는 종양은 종양 세포가 지속적으로 기질 (숙주 세포 및 세포 외 기질)과 상호 작용 생태계 있다는 실제적인 개념이며, 이들 분자 상호 침입 통해 그 미세 조정 ^(1)이다. 그래서, 분석에서 종양 세포 livi 직면종양 세포에 의해 침윤 용 기판으로서, 또한 간질 세포와 행렬 요소의 다른 유형의 소스로서 역할뿐만 NG 병아리 배아 심장 단편 ^2. 병아리 심장 근육 세포, 섬유 아세포 및 내피 세포를 포함하고, 세포 외 매트릭스는 라미닌, 피브로넥틴 및 콜라겐의 상이한 유형으로 구성된다. 이와 같이, 삼차원 기관 배양 기술은 환자의 종양 침윤에 관련 많은 세포와 분자의 상호 작용을 포함한다.

병아리 심장 분석의 주요 장점은 간질 효과를 구현 한 것이다. 이 측면은 기저막 ³ 간질 매트릭스 ⁴ 분자 구성이 아닌 생활 젤로 종양 세포 침공을 기반으로 체외에서 다른 침략 분석보다 더 완료됩니다. 장기 배양 실험에서 발견 된 바와 같이, 종양 세포 및 정상 생활 숙주 조직 사이의 대결의 개념은 여러 가지로 도입 된독일 ⁷ 울프와 슈나이더 프랑스 ^5, 영국 ⁶ Easty과 Easty 및 Schleich을 포함하여 저자. 위에 인용 된 방법 병아리 심장 침윤 분석의 기술적 장점은 두 조각의 양이 용이하게 표준화 될 수 있도록, 그들은 기관 배양 물 중에 기능적 무결성 모니터링을 허용 수축성 남아 있다는 것이다. 그들은 쉽게 계란의 멸균 콘텐츠 해부 될 수 있기 때문에 또한, 조류 배아 바람직하다. 분석은 종양 세포로 둘러싸 복잡한 기질을 제공하여 병아리 chorioallantois 막 세이 ⁸ 컨셉 유사성을 갖는다.

분석은 성공적 ⁹ 및 HCT-8 (결장) ¹⁰ 세포주 패밀리 MCF-7 (유방)과 같은 인간의 종양 침입 및 비 침습성 세포 변형을 구별하기 위해 적용되어왔다. 기술뿐만 아니라 잠재적으로 항 - 침습 화합물을 테스트하는 데 유용 ^{(11, 12). 상기 한 바와 같이, 그것은 작은 유기 분자의 구조 - 활성 관계의 확립을 위해 사용될 수있다. 분석은, 그러나, 계정으로 암 침공에 면역 세포의 기여를 고려하지 않습니다. 이는 기술이 때문에 조작의 높은 번호, 분석 런 제한된 숫자 (최대 30 배양)과 긴 턴어라운드 시간 (약 1 개월)의, 높은 처리량 분석 시스템으로 간주 될 수 없다는 것을 강조한다.}

그림 다른 분석 단계의 도식 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

예비 배양 심장 조각 1. 준비 (PHFs)

1. 구일 37 ° C에서 수정 된 병아리 달걀을 품어. (둥지 월요일에, 예를 들어) 종양 세포 집합체와 (목요일에, 예를 들어) 사일 동안 PHFs의 후속 준비를 할 수 있습니다 날짜와 마지막 대결하여이 부화를 완료합니다.
2. 물 70 % (v / v) 에탄올로 소독 쉘. 멸균 용액 및 재료를 이용하여 조직 배양 내각 모든 상기 조작을 수행. 무딘 집게를 사용하여 배아 극에서 쉘을 엽니 다.
3. HOL에 의해 배아를 잡아 당깁니다땡 안구 적출술 스푼 (그림 2)와 목. 링거액 염 용액 5 mL를 함유 5cm의 직경을 갖는 유리 페트리 접시에 배아를 놓는다.
   1. 두 손에 날카로운 집게를 사용하여 피부를 개방 추출하여 복부 흉부 피부를 열고, 조작의 동일한 유형으로 흉골을 제거하고, 주요 혈관을 분리하는 미세 절제의 홍채 절제술 가위를 사용하여 심장을 해부하다. 교정 된 안구 격자 macroscope에서 모든 추가 조작을 수행합니다.

안구 적출술 숟가락 달걀에서 배아를 리프팅 그림 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 유리 페트리 접시에 마음을 전송5 % 소 태아 혈청 MEM-레가 3 배지 5 ㎖를 함유 5cm의 직경. 미세 절제의 홍채 절제술 가위를 사용하여 심장의 위쪽 두개골 세 번째를 절제하여 심방 및 관련 혈관을 제거합니다. 날카로운 집게 한 쌍의 심실에서 심낭을 해부하다.
5. 가위 홍채 절제술 미세 절제를 사용하여 심실에서 시상 반 절단을 확인하고 부드럽게 날카로운 집게로 흔들어 피를 제거합니다.
6. 5 % 소 태아 혈청으로 신선한 MEM-레가 3 배지 5 ㎖를 함유 5cm의 직경이 다른 유리 페트리 접시로 심실을 전송. 미세 절제의 홍채 절제술 가위를 사용하여 직경이 약 0.4 mm의 조각으로 심실을 잘라. 한 마음이 약 100 조각을 얻을 수 있습니다.
   참고 : 하나의 마음이 약 100 조각을 얻을 수
7. 접시의 중심을 향해 모든 심실 조각을 구동하기 위해 조심스럽게 페트리 접시를 회전합니다. 9월에 의한 스테인레스 스틸 바늘로 모든 말뭉치의 aliena 제거심실 단편에서 그들을 arating와 배양 접시의 외주를 향해 이들을 구동.
8. 2 배지 (MEM-레가 3 플러스 10 % v / V를 소 태아 혈청) ml의 3에 포함 된 50 ㎖ 삼각 플라스크에 유리 파스퇴르 피펫으로 심장 조각을 전송합니다.
   유의 : 정확한 매질 부피는 개별 플라스크의 바닥 볼록 변수에 따라 달라 그 바닥의 중심은 액체 만의 얇은 막에 의해 커버 될 것이다.
9. 마개를 통해 공기 중 5 % CO _2의 혼합물과 플라스크 (들) 가스, 24 시간, 70 회전 / 분 (RPM)에서 37 ° C에서 진탕 gyrotory 플라스크 (들)를 배양. 이 현탁 배양 단계에 대한 이론적 근거는 종양 세포 응집체 후속 대진 적합한 구상 심장 조직 절편을 얻는 것이다.
10. 페트리 접시에 심장 조각과 그들의 문화 매체를 전송합니다. 바늘 말뭉치의 aliena, 괴사 (어두운) 조각, 심장 조각의 대기업을 폐기하십시오.
11. 또 다른 60 시간 동안 단계 1.9에 기재된 바와 같이 배양 배지 6 ㎖에 함유 다른 50 ㎖ 삼각 플라스크에 남아있는 심장 단편 인큐베이션.
    주 :이 배양 기간 동안 단편 구면해질 것이다. 그들은 근육 아세포의 코어 주변부 섬유 아세포 세포의 얇은 층으로 이루어져있다.
12. 섬유 아세포 세포의 얇고 균일 한 층 (반투명 캡슐을 형성하는)과 macroscope 및 바늘에 의해 0.4 mm의 직경을 나타내는 구형 단편을 선택한다. 한 여자의 마음은 약 20 적절한 PHFs을 얻을 것입니다. 신선한 배지를 포함하는 다른 페트리 접시에, 37 ° C에서 리드미컬하게 수축된다 많은 이들 PHFs을 전송. 이 PHFs 테스트 세포와 대결을위한 준비가되어 있습니다.

2. 준비 및 구상 테스트 세포 집합체의 대결

1. 반고체 한천 배지를 준비 : 세 번 끓여 링어의 염 용액 15 ㎖에 한천의 100 mg을 용해. 시원한소 태아 혈청 7.5 mL를 40 ° C의 서스펜션과는 링어의 염 용액 7.5 ㎖ / 계란 흰색 (1)를 추가합니다.
2. 50 ㎖ 삼각 플라스크에 그들의 적절한 배지에서 1 × ¹⁰⁵ 시험 세포 / ml를 함유하는 현탁액 6 ml에 준비한다. 대향 문화의 시작을 계획하기 전에이 삼일 마십시오. 3 일간 70 rpm에서 37 ° C에서 gyrotory 통에 플라스크를 품어. 사용되는 배지의 종류에 따라, 공기 중 5 % 또는 10 % (v / v)의 CO _2의 혼합물과 플라스크 기체.
3. 교정 된 안구 그리드를 장착 한 macroscope에서 집계를 볼 수 있습니다. 0.2 mm 직경의 구형 세포 집합체 (바늘)을 선택.
4. 반고체 한천 배지 ^(13)를 포함하는 손목 시계 배아 - 유리 배지 최소량 여덟 선택된 PHFs (직경 = 0.4 mm)을 전송할 파스퇴르 피펫을 사용한다. 원을 형성하기 위해 바늘로 개별 PHFs 이동합니다. 대기음 초과 매체여과지의 작은 조각을 사용하여 (도 3 참조).

PHFs 주위를 초과하는 액체의 그림 3. 흡인. 여덟 PHFs는 배아 시계 접시에 반고체 한천 상에 배치되고, 유체 과량 작은 삼각형 조각 연산 여과지로 제거된다. 화살표가 8 개인 PHFs을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 파스퇴르 피펫을 사용하여 원에 열 선택 회전 타원체 세포 집합체 (직경 = 0.2 mm)를 준비한다. 초과 매체를 대기음. 그들은 서로 접촉 할 때까지 바늘 (PHF)의 각 방향으로 한 집계를 이동합니다. 여과지의 작은 조각을 사용하여 과량 대기음 매체.
6. 파라핀과 시계 유리의 뚜껑을 밀봉하고, incuBATE는 4 ° C에서 37 - 24 시간, PHFs로 시험 셀의 접착 특성에 따라.
7. 예열 (37 ° C) 배양액 대향 쌍을 담그고, 및 배지 1.5 ml를 함유하는 5 ㎖의 삼각 플라스크에 파스퇴르 피펫으로 각 쌍을 전송.
8. 120 rpm으로 조정하여 37 ℃에서 gyrotory 진탕 플라스크를 품어. 시험 셀 (도 4 참조)에 사용되는 배지의 종류에 따라, 공기에 5 % 또는 10 % (v / v)의 CO ₂ 플라스크 기체.
   1. 미디어의 집중을 방지 링어의 염 용액 2 ㎖로 채워진 두 개의 추가 5 mL의 삼각 플라스크를 통해 전달하여 가스에 적셔 닦아내십시오. 매 8 일 문화 매체를 새로 고칩니다.

그림 4. 작은 삼각는 gyrotory 샥 위에 플라스크. ER 배지 1.5 mL를 플라스크에 가스 장착 실리콘 마개로 밀봉되어있다 -와 출구 바늘, 및 37 ℃에서 120 rpm으로 옮겼다. 기체 (3, 4) 분산 개별 마주 ​​쌍이 배양액 함유 작은 플라스크에 상기 멸균 링거 식염수로 채워진 큰 삼각 플라스크 (2)에 유입 튜브 (1)가 주도하고, (5, 6). 마지막으로, 폐가스는 멸균 트랩 큰 플라스크에 수집되어 (7)이 공기 중으로 빠져 나갈 수 곳에서 (8). 그림은 집에서 만든 플랫폼 판 위에 문화 배터리의 두 세트를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

대향 문화의 3 조직학

1. Bouin - 올랑드의 고정 솔루션을 준비합니다.
   1. 단일 증류수 100ml에 아세트산 구리 2.5 g (중립)에 용해시키고,천천히 피크르산의 4.0 g을 추가합니다.
   2. 종이 필터를 통해 용액을 여과. 포르말린 10 ㎖ 및 아세트산 1 ㎖를 추가합니다. 단일 증류수에 포화 염화 수은 용액의 1 부분이 솔루션의 9​​ 부분을 섞는다.
      주의 :이 솔루션은 여러 가지 유해 물질이 포함되어 있습니다. 포르말린은 피부 접촉, 흡입 독성, 그리고 경우가 삼킨. 아세트산은 섭취 후 입과 장관에 대한 부식성. 피크르산 빠르게 가열이나 충격에 의한 알레르기 때 폭발입니다. 염화 수은은 점막과 nefrotoxic에 매우 부식성이다. Bouin - 올랑드의 용액을 제조하기위한 보호 복 및 보호 장갑을 착용, 화재에서 환기가 잘되는 곳에서 원격에서이를 처리 할 수​​ 있습니다. 다른 정착 방법은 인산염 완충 식염수에서 4 % 포름 알데하이드에 기초한다.
2. 몇 일 또는 배양 주 다음과 같이 후 개별 문화를 수정합니다. 첫째, 벨소리의 소금 문화를 전송몇 초 동안 솔루션은 혈청 단백질을 제거합니다. 다음으로, 약 2 시간 동안 3 mL의 Bouin-올랑드의 정착 용액을 함유 3cm 직경의 배양 접시에 담가.
3. 가급적 고정액을 제거하기 2 시간 동안 물에 이들을 배양 전 배양 물을 3 ml의 탈회를 세 번 씻어. 마지막으로, 물 70 % (v / v) 에탄올 3 ㎖에 옮긴다. 이 솔루션 O / N의 문화를 유지, 그러나 이것은 일의 수를 확장 할 수 있습니다.
4. 2 시간마다 96 % 물 (v / v)의 에탄올, 100 % 에탄올, 100 % 이소프로판올, 및 100 %의 자일 렌 100 ㎖을 함유하는 병을 통해 순차적으로 전송함으로써 탈수.
   1. (자일 렌의 최소한의 금액) 별도의 유리 커버 슬립 각 문화를 전송, 파라핀 삽입을위한 와인 병 캡슐의 바닥에 커버 슬립을 배치하고, 56 ℃에서 액체 파라핀 왁스로 고정 재료를 커버한다. 24 시간 동안 56 ℃에서 인큐베이션 한 후 RT로 매립 재료를 냉각.
      주의 : 벤젠 유도체 자일 렌은 흡입 후 독성이있을 수 있습니다 만 통풍이 잘되는 지역에서 처리되어야있다.
5. 와인 병 캡슐 및 커버 슬립을 제거하고 고정 된 문화를 포함하는 파라핀 블록을 잘라.
6. 마이크로톰 ^(14)를 사용하여 전체 마주 보는 한 쌍의 8 μm의 두께 파라핀 섹션을 만들고, 점착 화제로서 조직 접착제 용액으로 전처리 된 세 교류 현미경 유리 슬라이드의 모든 부분을 모은다. 이 면역 염색을 방해 할 수 있기 때문에, 부착 제로 계란 흰색을 피하십시오.
   주 : 유리 현미경 슬라이드 전처리 조직 접착제 용액의 작은 방울 (1)과 파스퇴르 피펫으로 탈염수 (3)의 작은 방울을 제공하고, 슬라이드를 덮도록 혼합함으로써 수행된다.
7. 10 분 동안 100 ml의 100 % 자일 렌을 포함하는 항아리에 두 번 담금으로써 첫 번째 슬라이드에서 파라핀을 제거합니다.
8. 10 초 동안 침지하여 슬라이드를 재수크실렌 / 에탄올 (1 : 1) 물, 100 % 에탄올 96 % (v / v) 에탄올, 70 % 물 (v / v)의 에탄올, 마지막 탈염수 다음 용액 100 ㎖을 함유하는 병.
9. 물에 96 %의 요오드 (v / v)의 에탄올 (/ V W) 2 분 동안 0.5 %의 100 ㎖를 포함하는 항아리에 침수로써 염화 수은 결정을 녹인다.
10. 10 초 동안 물에 티오 황산나트륨 (/ V W) 5 %의 100 ㎖가 들어있는 항아리에 섹션을 취소합니다. 그런 다음 증류수에 철저하게 슬라이드를 씻어.
11. 2 분 동안 100 ㎖ 해리스 '헤 마톡 실린이 포함 된 항아리에 슬라이드를 품어 0.1 M 염산에 간단히 잠수함, 다음 10 분 동안 수돗물을 실행에 씻는다.
12. 1 분 동안 물 (/ V W) 0.1 % 에오신 100 ㎖가 들어있는 항아리에 품어.
13. 100 % 에탄올 회 탈염수 70 % (v / v) 에탄올 96 % (v / v) 에탄올, 자일 렌, 에탄올 : 용액의 다음 시리즈의 100 ㎖을 함유하는 병에 대한 간단한 침수 통해 탈수 (1 : 1) 그리고 마지막으로 100 % 크실렌.
14. 마운트슬라이드의 2 개의 별도의 중간 방울을 제공함으로써 매체를 장착과 슬라이드는 이들 위에 커버 슬립으로 바꾸어 이러한 확장하도록하고, 24 시간 동안 실온에서 경화하자.

4. 면역 조직 화학

1. 트리스 완충 식염수 (TBS)을 준비합니다. 트리스 (히드 록시 메틸) -aminomethane (트리스베이스)의 6.0 g 및 탈염수 4.5 L의 염화나트륨 45.0 g을 녹여. 1 M 염산 (약 42 ㎖)으로 pH 7.6로 가져와. 5 L.를 만들기 위해 증류수 추가
2. 트리스 - 염산 버퍼를 준비합니다. 순수 800 ml의 트리스베이스 60g을 녹인다. 6 M 염산 (65 ㎖)으로 pH 7.6로 가져와. 사용하기 전에 증류수로 희석 한 기사를 10 배를 만들기 위해 증류수를 추가합니다.
3. 트리스 BSA 0.1 % 버퍼를 준비합니다. 트리스베이스의 12.1 g 및 탈염수 4.5 L의 염화나트륨 45.0 g을 녹여. 1 M 염산 (약 42 ㎖)으로 pH 8.2로 가져와. 소 혈청 알부민 (BSA)과 _NaN3가 6.5 g 5.0 g을 추가한다. 5 L.를 만들기 위해 순수 추가
   주의 : NaN3를는 매우이다독성 제품. 산에 접촉하면 매우 유독 한 가스를 방출합니다. 장갑을 착용하고 꼭 섭취를 피한다. NaN3를 양식 구리, 납 등의 금속과 매우 민감한 폭발성 화합물. 충분한 양의 물로 세척 싱크. 다른 방부제는 0.01 %의 티오 메르 살입니다.
4. 항목에게 3.10에 3.2을 따릅니다.
5. TBS 또는 트리스 0.1 % BSA 버퍼에있는 슬라이드를 찍어, 및 종이 타월을 사용하여 섹션 주위를 초과하는 액체를 닦아.
6. CO 대한에서 BSA (/ V w) 트리스 0.1 % TBS 또는 5 %의 고습도 챔버에 30 분 동안 BSA 버퍼 (/ V w) (폐쇄 상자 희석하여 150 ㎕의 정상 염소 혈청 1:20 적용 내부 습도가 높은 보장 오픈 워터받는 사람)와 슬라이드의 -incubation. 그런 다음 종이 타월로 여분의 유체를 제거합니다.
7. 고습 챔버 내에 적어도 2 시간 동안 1 % (v / v)의 정상 염소 혈청 BSA (/ V w) 트리스 - 0.1 %로 희석 한 150 ㎕의 차 항혈청을 적용한다. 차 항혈청의 최적의 희석을 결정 empiri으.
   주 : 면역 병아리 심장 항원을 검출하는 데 사용될 수 있지만, 특정 항체를 사용하여, 병아리 심장 항원 기재된 기술뿐만 아니라 (예컨대, 녹색 형광 단백질과 같은) 다른 항원 ^(15)에 적용될 수있다.
8. 5 ~ 10 분 동안 흔들 테이블에 BSA V / w 트리스 0.1 %에 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
9. 페이퍼 타월을 사용하여 과량의 액체를 제거하고 150 ㎕의 과량의 염소 항 - 토끼 항혈청을 적용 (예., TBS에서 1:20)는 적어도 1 시간 동안 고습 챔버.
10. 5 ~ 10 분 동안 흔들 테이블에 TBS로 두 번 씻으십시오.
11. 종이 타월을 사용하여 여분의 유체를 제거합니다. 높은 습도 챔버에 적어도 1 시간 동안 1 % (v / v)의 정상 염소 혈청 TBS에서 250 : 1 희석 된 퍼 옥시 다제 - 안티 - 퍼 옥시 다제 복잡한을 적용합니다. 복잡한의 희석 배치에 따라 달라집니다.
12. TBS로 슬라이드를 씻고 트리스 - 염산 완충액 pH 7.6로 전송할 수 있습니다.
13. 트리스에 슬라이드로 이동몇 분 동안 미노 0.25 G / L와 0.01 % (v / v)의 H ₂ O _2를 포함 HCl 완충액. 여자의 마음 스테인드 때 부화를 중지합니다. 현미경으로 정기적으로 확인합니다.
14. 증류수를 10 분 동안 트리스 -HCl로 슬라이드 이동하고.
15. 항목 3.13 및 3.14을 따르십시오.
    참고 : 쉽게 고정 동안 파괴 항원의 경우, 문화의 냉동 절편은 면역 조직 화학 분석을위한 대안을 제공 할 수 있습니다. 이는 다음 단계 프로토콜에 설명되어
16. 혈청 단백질을 제거하는 링거 염 용액 3 ㎖로 리빙 배양을 씻는다.
17. cryomicrotome의 예비 냉각 (-16 ℃) 시편 홀더에 매체를 삽입 한 방울을 추가합니다. 가 완전히 고정되기 전에이 드롭의 상단에 유리 커버 슬립의 가장자리에서 배양 조직을 전송합니다.
18. 6 μm의 두께 동결 절편을 잘라 ° C ~ -16 문화 쿨, 젤라틴 코팅에 그들을 수집유리 슬라이드.
19. 4 ℃에서 저장하기 전에 10 분 동안 4 ° C에서 아세톤에 슬라이드를 고정합니다.
20. 항목에게 4.15에 4.5을 ​​따릅니다.

분석 결과 5. 평가

참고 : 본 분석에서, 침략이 직면 테스트 세포에 의해 (PHF)의 진보적 인 직업으로 정의된다. 대치 배양에서 모든 연속 섹션 현미경 분석은 시험 전지 집합체와 입체적 PHFs 간의 상호 작용의 재구성을 허용한다.

1. 상호 작용 및 다음 스케일에 따라 등급의 다른 패턴을 관찰한다 (도 5 참조).
   학년 0 : 만 (PHF) 관찰했다. 아니오 대향 세포가 관찰 될 수 없다.
   등급 I는 : 대향 시험 셀은 PHF에 부착되지만, 심장 조직, 심지어 최 섬유 아세포 세포층을 차지하지 않는다.
   학년 인천 : (PHF)의 직업은 외부 섬유 아세포와 같은과 근원 세포 CE로 제한됩니다LL 층.
   등급 IIB는 : (PHF)는 세포 집합체를 포위했지만 직업의 흔적이 없습니다.
   등급 III : 대향 세포 PHF 점유했지만, 그대로 심장 조직의 최초 양의 절반 이상 남아있다.
   학년 4 : 직면 세포 (PHF)의 원래 볼륨의 절반 이상을 차지했다.
   참고 : I 및 II는 비 침습적 세포 집단으로 관찰되는 성적을 등급 III 및 IV는 침략의 전형적인한다. 다른 시간 프레임 내에서의 진행을 평가하기 위해, 조직 학적 분석은 다른 배양 기간 후 배양 고정 대향 적용되어야한다.

직면 암 세포와 PHFs 사이의 상호 작용 5. 예를 그림. 문화를 직면의 조직 학적 섹션 스테인드 중 헤 마톡 실린 - 에오신 (왼쪽 패널) 또는 immunohistochemicall와여자의 마음 (오른쪽 패널)에 대한 항체와 Y. 상호 작용 성적 프로토콜 텍스트에 정의되어 있습니다. (H : 심장 조직, T : 종양 세포). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 독성 평가 약물 치료 후

1. 파스퇴르 피펫으로 24 잘 조직 배양 multidishes에 최소한의 볼륨에 직면 문화를 전송합니다.
2. 마약없는 배지 500 μl를 추가하여 문화를 세척하고, 6 시간 후 새로 고침.
3. 거꾸로 현미경 (대물 렌즈 40X)를 사용하여 외식에서 세포 생장 매일 모든 우물을 검사합니다. 대향 문화 생존 지수를 구하는 외식 문화의 총 수에 의해 배양 물을 벗어나지 수를 나눈다. 용매 처리 된 사람과 약물 치료를 문화의 결과를 비교한다.
   주 : 셀 prolif 용 사료된다 면역 조직의 사용 (eration)과 TUNEL 분석의 ()에 대한 세포 사멸은 독성을 평가하기위한 절편 분석을 보완 기술로 제안된다.

적대감 문화 7. 성장 평가

1. 디지털 카메라 건전지 장착 된 현미경을 사용하여, 단지 고정하기 전에 문화의 흑백 사진 만들기 (대물 렌즈 50X)
2. MM에서 고려 배율을 가지고 문화의 (a)는 크고 작은 (b)는 직경을 측정한다.
3. 식 ^(16)을 통해 ³ mm에서 대략 부피 (V)를 계산
4. V = 0.4 xaxb ²
5. 대립의 시작 PHF 세포 집합체의 조합 볼륨이 최종 용적을 비교하여 배양의 성장을 계산한다.
   주 : 독방 PHFs는 배양시 부피를 감소시키는 경향이 있기 때문에, 대향하는 쌍의 성장은 종양 세포에 의존한다.

도 5에 제시된 조직 학적 단면은 성공적인 분석의 숫자의 최종 결과를 나타낸다. 문화의 소리 조직학가 가능한 세포를 표시하고 종양 세포와 정상 조직 사이의 상호 작용을 해석 할 수 있습니다. 또한, 정상 조직에서 어떠한 면역 반응은 면역 거부 시스템이 개발되기 전에, 예를 들어 사용 된 병아리 배아의 정확한 기간을 확인하는 관찰 할 수 없다. 배양 기간 동안 (총) 오염의 부재를 나타냅니다 볼 수없는 박테리아는 없습니다. 마지막 부분의 둥근 가장자리는 삼각 플라스크 벽에 (임시) 준수의 흔적없이 서스펜션의 문화를 확인합니다.

많은 화합물 분석에서 테스트되었습니다. 직면 PHF / 종양 집계 쌍 작은 삼각 플라스크 (단계 2.7)이 이전 된 시점에 약은 일반적으로 순간에 문화 매체에 전달됩니다. 일부에 공지 (도구로서 사용hibitors과 활성제) 종양 침윤 과정에 연루 경로와 이펙터 분자를 해명합니다. 구조적으로 관련이 있었다 다른 화합물의 경우, 정량적 구조 활성 관계 (QSAR)는 병아리 심장 침공 분석의 결과를 바탕으로 설립되었습니다. 그래서, 종래 폴리 페놀에 대한 계산 디스크립터 번호 분석에서 그들의 항 - 침습 활동의 예측을 가능하게하는 데 사용되었다. 15 년에 걸쳐 139 가지 유사체는 분석에서의 가능한 침입 방지 효과에 대해 시험하고, 그들의 활동을 4 종류로 분류 하였다. 교육 및 93 각각 그 폴리 페놀의 (46)로 구성된 검증 세트는 무작위로 선정되었다. QSAR 인공 신경망에 의해 상기 검증 집합의 결과 (도 6 참조) 및 예측 실험 항 침습 활동 ¹⁷ 사이에 명확한 상관 관계를 보였다.

데이터 번째의 강인성을 보여전자 병아리 심장 침공 분석, 예측 및 실험 결과 사이의 상관 관계는 15 년 동안 유효하고 다른 폴리 페놀과 최근 (미 출판) 예측 연구에서 확인되었다 때문이다. 그림 6에 제시된 혼란 행렬은 약점과 그래픽 분석의 힘을 요약은 정확성과 재현성의 거친 표현을 제공합니다. 이 그래프의 해석은 고려 기관의 문화 생활의 생물학적 다양성 및 침입 결과의 반 정량적 점수를해야합니다.

그림 6. 병아리 심장 침공 분석에서 작은 분자의 활동에 대한 예측 QSAR 모델 (인공 신경망)의 외부 검증. 이 모델의 출력은 화합물의 항 - 침습 활동 클래스이다. 네 같은 클래스가 정의 된,를 repr분자 반 침습적 활동 발휘하는 가장 낮은 농도 esenting (즉, 침략 등급 I 또는 II) 치 분석에서 : 클래스 4 (아래 1 μm의 활성), 클래스 3 (10 μM), 클래스 2 (100 μM) 및 클래스 1 (100 μM의 높은 농도 앤티 침습적 활동). 도시 혼동 행렬은 예측과 실험적으로 검증 세트의 화합물의 항 침략 활동 클래스를 결정 비교합니다. 검증 세트는 훈련 93 모델 예측만으로 분자 구조에서 계산 된 기술자에 기반으로 설정, 따라서 가상의 화합물에 대해 얻을 수있다 (46) 화합물이 포함되어 있습니다. 이 방법은, 합성 노력이 실리 활동에 약속과 분자에 집중 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PHFs의 제조 동안, 단편 현탁액에 체류하지 않을 수도 있지만, 혈관 벽에 부착; 이는 배양액의 부피를 증가시킴으로써 극복 될 수있다. PHFs 수가 너무 낮고, 그 크기가 너무 큰 경우, 배양액의 부피를 감소시킨다. 집계 테스트 세포의 실패는 온도 나 미생물 감염에 변동 때문일 수 있습니다. 또한, 집계 무능력 세포의 고유 한 특성 일 수있다. PHF에 골재의 부착 동안에, 접착 불량은 반고체 한천 배지 위에 잠복기를 연장하거나 여과지 흡수에 의해 배양 주위 이상의 유체 배지를 제거함으로써 극복 될 수있다. 이 경우 미생물 오염에 대해서도 확인합니다. 절편 동안 어려움 파라핀 블록의 분해에 기인 할 수있다 : 블록의 저장 기간 (한번 용융 파라핀) 너무 오래 되었으면이 발생한다. 예술 절편 때ifacts은 마이크로톰 나이프의 무결성 및 고정 문화 코퍼스의 aliena의 유무를 체크해야 일어난다. 문화 괴사 지역은 가난한 배양 조건의 징후이다. 이러한 영역은 문화 중심지에 한정되는 경우, 하나는 너무 커서 인 대립의 볼륨을 의심한다. PHF 세포 집합체의 볼륨의 적절한 선택은 참으로 중요한 요소이다. 그러나 더 부적절한 pH 조절, 미​​생물 오염 또는 고정 아티팩트으로 괴사 점을 일반화. 섹션이 너무 어둡게 나타날 때 마지막으로, 헤 마톡 실린에 침지 기간이 너무 오래있을 수 있습니다, 또는 섹션이 너무 두꺼운 경우 일 수 있습니다 (> 8 μm의).

병아리 심장 분석에 많은 변화가 침공 연구에 성공적으로 적용되고있다. 이러한 변화는 숙주 조직, 대향 시험 셀의 프레젠테이션 및 배양 조건의 기원에 관한 것이다. 종에서 심장 조각병아리 ^{(18) 이외의,도 19과} 같은 간, 폐 ⁽²⁰⁾ 및 ⁽²¹⁾ 등의 뇌 조직에서 관찰되었다. 대신 골재, 생검 ²² 단층 단편 ²³ 표본, 세포 현탁액을 기관 배양 물에서 PHF와 대면하는데 사용되어왔다. 서스펜션 배양 때때로 반고체 기판 ^(24)의 상부에 정적 배양에 의해 대체되고, 혈청이없는 대립은 셀 ^(25)의 특정 유형에서 실현 가능한 것으로 나타났다. 일반적으로, 상호 작용은하지만 반 정량적 스케일 ^(26)에 따라 설명되고, 컴퓨터를 이용한 자동화 된 이미지 분석 시스템도 ^27,28를 개발되었다. 후자의 목적은 종양 세포의 침윤 정도에 정량적 인 정보를 제공한다.

병아리 심장 분석법 생물 숙주 조직을 포함 바와 같이, 생체 내에서 설치 상황 요점을 되풀이 시도하고 명확 O 비해 약간 관련이있다체외에서 거기 시스템 (소개 섹션을 참조하십시오). 이것은, 그러나, 상기 분석은 천연 종양, 예컨대 면역 학적 요인 암세포의 침습 행동에 영향을 미칠 수있는 환경에서 본 microecosystem의 모든 요소를​​ 포함하는 것을 실패하는 것으로 인식되어야한다. 적어도 하나의 연구에서 분석에서 같은 요소의 부재는 병아리의 심장 ^(29)의 분석 결과와 동물 모델 ^(30)의 그 사이에 충돌하는 결과를 이끌어왔다.

미래의 응용 프로그램은 분석에서 심근 전구 세포의 연구가 될 것이다. 이들 세포는 심근 경색 환자의 치료 영역으로 주입 될 수 있지만 심근에 통합 할 수 있어야한다. 병아리 심장 분석에서 전구 세포는 병아리 심장 단편 직면하게 될 것이고, 자신의 이동과 분화를 분석한다.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).