두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

두개골 mesenchyme 가능성이 신경 주름 상승을위한 원동력을 제공 극적인 morphogenic의 움직임을 겪 ^1,2. 여기 간단한 설명 예 생체 neurulation 동안 두개골 mesenchyme의 세포 행동을 성격 분석을 explant. 이 분석은 약리 조작 및 라이브 영상 분석에 대한 의무를 포함하는 다양한 응용 프로그램이 있습니다.

중추 신경 시스템은 neurulation으로 알려진 과정에서 신경 튜브의 형성의 결과로 복잡한 morphogenetic 운동의 시리즈를 거쳐 신경 판에서 파생됩니다. neurulation 동안, 신경 판을 underlies mesenchyme의 morphogenesis는 신경 배 상승을 유도 할 생각됩니다. 두개골 mesenchyme은 paraxial 중배엽과 신경 크레스트 세포로 구성되어 있습니다. 두개골 mesenchyme 양식의 세포 별 모양의 모양의 세포로 구성하고 신경 주름을 지원하는 세포 외 기질 (ECM) 가닥을 intermingling pourous meshwork. neurulation 동안, 두개골 mesenchyme는 확장의 결과로 틀에 박힌 rearrangements를 겪 이러한 움직임이 신경 배 상승을위한 원동력을 제공하기 위해 믿고 있습니다. 그러나 두개골 mesenchyme의 morphogenesis을 유도 경로 및 셀룰러 행위는 제대로 공부 상태입니다. ECM과 두개골 mesenchyme underly thes의 세포 사이의 상호 작용전자 셀 행동. 여기이 세포의 행동을 특성화 고안 간단한 예를 생체의 explant 분석을 설명합니다. 이 분석은 또한 이러한 세포의 동작을 특성화 관련 신호 경로, 라이브 영상 분석을 해부하는 약리 조작에 수정할 수있는 것입니다. 우리는 ECM 구성 요소의 다양한 두개골 mesenchyme의 이동 특성을 특성화이 분석의 유틸리티를 보여주는 대표적인 실험을 제시한다.

두개 지역의 신경 튜브 폐쇄는 배아 일 8.5 (E8.5)와 마우스 배아 9.5 사이에 발생합니다. 제대로 anencephaly, 인간의 일반적인 구조 출생 결함의 머리 결과에 신경 튜브를 닫고하지 않으면 생명과 호환되지 않습니다. 두부 신경 튜브 폐쇄를 운전 세력은 신경 조직 자체와 주변 표피와 mesenchyme ³ 모두에서 생성됩니다. 두개골 mesenchyme의 특정 확장에는 두개골 신경 주름의 ^1,2 상승을 위해 필수적이라고 생각합니다. 두개골 mesenchyme은 헤파린 황산염의 proteoglycans, 콘드로이틴 sulfates과 hyaluronate ^4-8와 같은 특정 glycosylated 단백질의 ECM 단백질이 풍부하다.

신경 크레스트 세포가 신경 튜브 폐쇄에 따라 등쪽의 신경 튜브의 이민 닭의 배아에서와 달리, 마우스의 배아에서 신경 문장은 신경 주름이 연구에 시작하는 동시에 마이그레이션이세 (5 체절 단계 이후). 따라서 마우스 배아의 neurulation 동안, 두개골 mesenchyme은 신경 문장과 paraxial 중배엽에서 파생 된 세포로 구성되어 있습니다. 신경 문장과 paraxial 중배엽 집단은 개발에서 다른 시간에 유도되며, 배아의 여러 위치에서 지역화 및 다른 구조 ^9,10으로 개발할 수 있습니다. paraxial 중배엽은 원시 줄무늬에서 유래하여 추정 신경 판을 기초하는 배의 앞쪽 지역 마이그레이션합니다. 신경 문장은 신경 플레이트와 표피 외배엽의 교차점에서 유도되며, 전환을 mesenchyme하는 상피를 겪과 쥐의 배아에서 신경 배 상승 직전에 delaminates. 신경 크레스트 세포는 아가미의 아치, frontonasal 및 periocular mesenchyme에 subectodermal paraxial의 중배엽에서 stereotypic 길을 따라 마이그레이션됩니다. paraxial 중배엽은 두개골 천장과 얼굴 근육의 뼈의 일부에 기여할 것이다; 반면 일전자 신경 문장은 두개골 신경 ^9-11에 추가 두개골과 얼굴의 다른 뼈에 기여하는 것입니다. paraxial 중배엽과 신경 문장의 lineages은 differentially 각각 ⁹ Mesp1-cre과 Wnt1-cre 유전자 변형 마우스 라인에 의해 표시 될 수 있습니다.

신경 튜브 폐쇄의 두개골 mesenchyme의 필수 역할이 실험에서 유추 된 지역 ECM 이러한 neurulation 장애인 신경 튜브 폐쇄 ^7시 hyaluronidase, chondroitinase ABC, heparitinase 또는 디아 조 - 옥소-norleucine (돈)와 같은 에이전트를 방해과 쥐 배아의 ^{치료, 12-14.} 이 실험에서, neurulation 다음 정적 섹션의 조직 학적 분석은 두개골 mesenchyme ^7,12-14의 관련 dysmorphogeneis을 공개했다. teratogenic 에이전트가 여러 조직에 대한 액세스 권한을 가지고 있기 때문에,이 두개골 mesenchyme 정말 대상 조직 경우 결정하기 위해 남아 있습니다. 결론 지원에 해당이 조직neurulation에 필수적이며, 두개골 mesenchyme는 exencephaly ^15-17과 일부 마우스 돌연변이의 조직 학적 분석시 이상 나타납니다. 하지만, 대부분의 경우에, 두개골 mesenchyme의 세포 행동에 돌연변이의 효과는 해결되지 않았습니다.

우리는 직접 두개골 mesenchyme 세포 ¹⁵ 행동에 유전자 변이 또는 약리 조작의 결과를 검토 할 수있는 전직 생체의 explant 분석을 고안했습니다. 이 분석은 두개골 mesenchyme의 차별화 가능성에 액세스 할 수 Tzahor 외 2003 출판 비슷하다 그 underlies 앞 신경을 기초 우리가 두개골 mesenchyme이 더 앞쪽에 인구의 이동 특성을 연구 explant의 절개를 수정 한 경우를 제외하고 rhombomeres ¹⁸ 판. 우리의 방법은 KE로 신경 문장의 이동 행동을 분석 할 닭의 배아에서 수행 explant의 assays의 수정입니다Y 차이. 이전 준비는 각각의 문장이나 더 뒤쪽 paraxial 중배엽 ^19,20을 explanted 있습니다. 또한, 닭의 배아에서 신경 배 상승하는 동안, 신경 문장은 아직 등쪽의 신경 튜브로부터 이민 오지 않았으며, 따라서 앞 paraxial 중배엽의 촬영 explants는 신경 크레스트 세포를 포함하지 것입니다. 우리의 분석에서 paraxial 중배엽, 신경 문장 및 표면 외배엽으로 구성된 두개 mesenchyme의 explants은 기판에 준비 도금되어 있습니다. 유전자 돌연변이의 explants의 고립, 다른 ECM 또는 약리 치료에 explants를 도금 등의 실험 조작을 수행 할 수 있습니다. explant과 거리 번호와 행동의 세포 마이그레이션 분석 및 치료 그룹 사이를 비교할 수 있습니다. 또한이 준비 라이브 영상 기술에 의한 세포 이주의 분석에 수정할 수있는 것입니다. 모피로 마이그레이션 실험 후, explants가 해결 될 수 있으며 immunohistochemical 분석의 대상이트리트먼트의 효과를 명료하게하다 군터. 전체에서 여기에 제시된 프로토콜은 두개 mesenchyme의 동작을 조사하는 간단한 예를 생체 분석이다. 대표 실험으로, 우리는 서로 다른 세포 기판에 두개 mesenchyme의 마이그레이션을 검토하는이 분석을 활용한다.

1. ECM 코팅 문화 요리 나 Coverslips의 작성

1. PBS의 EC​​M 기판 (Dulbecco의 식염, Invitrogen, # 14040-133를 인산 버퍼)를 용해하여 ECM 주식 솔루션을 준비합니다. -80에서 0.2 mm 주사기 필터 (VWR, # 28145-495)와 aliquots에서 동결 ° C.를 사용하여 필터
2. PBS에서 원하는 농도에 ECM 주식 솔루션을 희석. MaxGel를 들어, DMEM (Dulbecco의 수정 된 이글 매체, Invitrogen, # 11995-065)에 희석.
3. immunofluorescence을 수행 할 경우, 에탄올에 찍어으로 12mm 원형 유리 coverslips (VWR, # 89015-724)을 소독하고 건조 공기 수 있습니다. 이것은 무균 층류 후드에서 수행해야합니다. immunofluorescence을 수행 할 수하지 않을 경우 1.5 단계로 건너 뜁니다.
4. 장소 (코닝, # 3526) 24 잘 플레이트의 각 우물에 coverslips을 소독.
5. 3 시간 동안 실온에서 24 잘 플레이트와 배양의 각도에 희석 기판 솔루션의 0.5 ML를 추가합니다.
6. ECM 솔루션을 기음과 thre을 씻어PBS에 전자 시간.
7. PBS를 대기음 즉시 사용하거나 parafilm에 싸여과 4에서 ° C 최대 2 주까지 보관.

2. 해부 도구의 작성

추가 숯불로 Sylgard 판은 제조의 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다. 이 접시의 강한 검은 색 배경은 배아를 달아과 색상이 반투명 배아를 시각화 용이 들과는 좋은 대조를 제공에 대한 지원을 제공합니다.

1. 접시를 준비하려면 균형 150g 부품 액체 15g 파트 B와 1g의 숯 가루 (세계 정밀 계측기, # SYLG184)에 트라이 - 부어 비커에 직접 무게. 나무 아이스크림 스틱이나 혀 억압자를 사용하여 함께 섞는다. 유리 또는 플라스틱 100cm 요리에 넣어. 모든 거품을 구울 수있는 요리 위 10~12인치에 대해 개최 소형 부탄 토치를 사용하십시오. 장소 접시에 뚜껑과 그냥 놔 설정하기 최소 24 시간에 앉아.
2. (0.1 mm의 diamete Minutien 핀 삽입 분해 도구를 준비하려면R) 핀 홀더 (정밀 과학 도구, # 26002-10와 # 26018-17, 각각) 또는 26 게이지 바늘 (BD, # 309597) 포셉의 도움을 직각으로 구부러로는 악기를 해부로 사용할 수 있습니다. 가는 돌 (정밀 과학 도구, # 29008-22)를 사용하여 날카롭게 학생 뒤몽 # 5 포셉 (정밀 과학 도구, # 91150-20).
3. 사용하기 전에 70 %의 에탄올과 함께 모든 해부 도구를 살균.

3. 태아의 수집

1. 동물 사용위원회 규정에 따라 8.5 일 게시물 coitum에서 시간이 초과 임신 마우스를 안락사시켜야하고 자궁을 제거합니다.
2. 멸균 PBS와 플라스틱 배양 접시에있는 장소 자궁.
3. 멸균 PBS로 한 번 자궁을 씻는다.
4. 해부 현미경 아래에서 조심스럽게 포셉 한 쌍의를 사용하여 deciduas에서 배아를 제거합니다.
5. extraembryonic 세포막을 제거하고 필요한 경우 genotyping에 저장합니다.
6. somites를 계산하여 스테이지의 배아. 이상적인 단계 explants는 세포 beh을 분석 할 수 있도록하는신경 배 상승하는 동안 av​​ior는 각각의 주름 막 상승하기 시작하여 두개골 mesenchyme의 주요 morphogenesis이 일어나기 전에 6 및 10 체절 단계 사이 여야합니다.
7. PBS에서 배아를 씻으십시오. 더 페놀 레드 (Invitrogen, # 21063-029)을 포함하지 DMEM과 검은 색 sylgard 접시에 장소. extraembryonic 멤브레인을 제거하고 필요한 경우 genotyping에 저장합니다.

4. Explants의 작성

1. 태아의 머리 지역에 걸쳐 가장 높은 배율의 현미경 촛점을 다시 맞춰.
2. 각 손에 분해 바늘로 상처를합니다. 상처를 만들기 위해 장소에서 조직 및 기타를 개최 한 바늘을 사용합니다.
3. rhombomeres에 앞 배의 머리를 잘라.
4. 2 개의 같은 절반으로 머리를 두 갈래로 갈라지다하는 중간 선을 따라 자른다.
5. 머리와 중간 선의 외부 가장자리 주위에 자른다. 이러한 상처는 외부 국경에서 premigratory 문양과 표면 외배엽을 제거하고합니다중간 선에서 prechordal 판. 나머지 조직은 explant되며 마이그레이션 두개골 신경 문장, paraxial 중배엽 및 표면 외배엽이 포함됩니다.
6. 조직이 절단되면서 살균 파스퇴르 피펫을 사용하여 요리를 분석하던 쓰레기를 제거합니다. 이 해부하는 파편으로 explant를 혼란 방지 할 수 있습니다.
7. 부드럽게 20 μl 피펫 팁과 pipetman와 등을 아래로 pipeting하여 explant을 씻는다. 이 느슨하게 연결된 세포를 제거하고 explants의 계단 가장자리를 방지 할 수 있습니다.
8. 조심스럽게 20 μl 피펫 팁과 pipetman 잘 코팅 된 문화의 중심으로 자리를 사용하여 액체의 약 10 μl 각 explant를 선택합니다.
9. explant를 커버 15 % FBS와 보충 문화 미디어 20 μl를 추가합니다.
10. 1-2 시간의 humidified 조직 문화 인큐베이터 (5 % CO _2, 37 ° C)에서 개최 판은 explant은 접시의 바닥에 부착 할 수 있습니다. explant이 건조하지 않도록 주기적으로보기아웃.
11. explant가 첨부되면, 조심스럽게 ° C waterbath에서 37 예열 된 10% FBS와 보충 각도 250 μl DMEM에 추가 할 수 있습니다. 일단 explants 판은 부드럽게 현미경 떨면서 때 이동하지 않습니다 첨부했습니다.
12. 조직 문화 인큐베이터로 요리를 반환합니다.
13. 24 시간 후, explants가 단단히 부착되고 세포가 이주가 시작됩니다. 현재 약리 대리인은 미디어에 추가 할 수 있습니다.
14. 48 시간 도금 후, 세포는 explants에서 마이그레이션해야합니다. 마이그레이션 거리 시각화 및 이미징 할 수 있습니다. explants이 더 incubations과 감소 생존의 흔적을 보여 시작부터 우리는 일반적으로이 시점에서 문화를 중지합니다. 이러한 acridine 오렌지 나 trypan 파랑 등의 얼룩 중요한 또한 explant의 생존을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
15. 이 시점에서 이미지는 explant에서 마이그레이션 셀의 거리와 번호를 문서화하는 취득 할 수 있습니다. 또는, 만약 explants는 coverslips에 도금 된그들은 고정 및 immunohistochemical 분석은 관심 단백질을 시각화하기 위해 수행 할 수 있습니다.

프로토콜의 중요 단계

1. 거의 같은 크기의 explants를 자른다.
2. 원하는 explanted 조직과 혼란 파편을 피하기 위해 해부대로 해부 접시에서 모든 분해 파편을 해제합니다.
3. 우물이나 coverslips에 도금 explants 잘의 중심에 explant과 미디어의 비말을 배치해야합니다.
4. 미디어와 우물을 홍수 전에 첨부 할 수있는 충분한 시간을 explant 수 있습니다.
5. 치료 조건은 사용하는 모든 테스트 기판 및 약리 에이전트에 대한 표준화해야합니다.
6. 두 explants은 (왼쪽에서 하나 신경 튜브의 오른쪽에서 하나) 각 배아에서 만들 수 있습니다.
7. 다른 실험 조건에서 돌연변이 마우스 라인에서 세포의 이주를 테스트를 할 때, 치료를 그룹에 포함 된 하나 돌연변이 제어 그룹의 explant과 다른 놔.

문제 해결

1. explants 첨부하지 않는 경우, 첨부 파일 할당 된 시간을 향상시킬 수 있습니다. 우리의 경험에서 explants의 약 절반은 첨부하지 않고 큰 explants 더 효율적으로 준수합니다.
2. explants는 우물의 주변에 부착하면 그 이미지 어려울 것입니다. 우물의 중심에 explants를 배치해야합니다.
3. 이상적으로 explants 약 같은 크기가 될 것입니다. 그러나, explant 크기 차이가 explants 세포 마이그레이션을 quanitating 때 보정 계수로 explants의 직경을 사용하기 위해 수정 될 수 있습니다.
4. 오염이 발생하면 살균 된 연구 조건이 사용중인하십시오. 모든 도구와 작업 표면은 70 % 에탄올로 소독해야합니다. Pipets와 페트리 요리 새로운 살균해야합니다.
5. explants은 절개 중에 손실 발생하면 주기적으로 explant을 잃지 방지하기 위해 쓰레기를 제거합니다.
6. 마스터 해부 시간이 소요됩니다 연습이 걸립니다. Opti말 배율, 날카로운 해부 도구와 바늘 도움말.

두개골 mesenchyme의 explants에서 마이그레이션 세포의 모양은 그림 2에 표시됩니다. , Laminin (100 MG / ML, 시그마 # L2020), MaxGel ECM (DMEM에 1:500 희석, 우리는 Fibronectin (시그마 # F​​1141 100 MG / ML)를 포함 neurulation 동안 두개골 mesenchyme에 존재하는 다양한 ECM 기판에 마이그레이션을 테스트 , 시그마 # E0282)와 Hyaluronic 산 (1 MG / ML, 시그마, # 53747). 더 ECM합니다 (데이터 미도시)에 존재하지 않습니다 때 세포는 explant에서 마이그레이션이 실패하고 모든 기판은 세포의 지원 마이그레이션을 테스트. 모양뿐만 아니라 explants에서 마이그레이션 세포의 크기는 모두 기판에 따라 달라집니다. 이전 연구는 다른 ECM과 세포의 상호 작용에 의해 생성되는 기계적 힘이 셀 ^(21)의 모양과 철새 특성을 모두 영향을 설명으로 이것은 예상된다.

1 그림. explants의 준비. (A) explants를 준비하려면이 E8.5 배아는 deciduas와 extraembryonic 조직 분석하던됩니다. (B) 배아 헤드가 몸 앞쪽에서 rhombomeres로 해부하고 있습니다. Explants는 각각 국경의 중간 선 및 premigratory 신경 문장과 표면 외배엽에서 prechordal 판을 제거하는 중간 선 및 머리의 바깥 가장자리에서 조직을 제거하여 준비가되어 있습니다. (C) Explants은 중간 선 및 테두리의 premigratory 신경 문장과 표면 외배엽에서 prechordal 판을 제거하는 머리 중간 선 및 외부 가장자리에서 조직을 멀리 절단하여 준비가되어 있습니다. (D) Explants는 ECM 코팅 요리 / coverslips에 미디어의 작은 볼륨에 배치하고 더 많은 미디어를 추가하기 전에 첨부 할 수 있습니다.

그림 2. 다른 기판에 도금 explants에서 두개골 mesenchyme 세포의 마이그레이션. Explants는 Fibronectin, Laminin, MaxGel ECM 또는 Hyaluronic 산에 도금과 문화에서의 48 시간 후 사진되었다. 크기 바 = 200mm.

여기에 적용 방법은 두개골 mesenchyme 세포의 동작을 검사 할 수있는 강력한 분석을 제공합니다. 여기에 제시된 정적 분석뿐만 아니라, GFP-라벨 단백질의 표현으로 시야 또는 조합 이미징 실험을 살고들은 explant에서 마이그레이션로 실시간으로 세포의 행동을 검토하는 고용 할 수 있습니다. 라이브 이미징 실험 explants는 DiI로 표시 될 수 또는 paraxial 중배엽, 로사-YFP에서 신경 문장의 마이그레이션을 차별화하는 데, Mesp1-cre이나 로사 - YFP, Wnt1-cre 또는 기타 유전자 변형 라인을 사용할 수 있습니다. 두개골 mesenchyme-ECM 상호 작용도이 explant 분석을 활용하여 검토 할 수 있습니다. 여기 그 세포가 다른도에 이러한에 이전하고 ECM은 세포의 형태에 영향을 미치는 것을 보여주기 위해 두개골 mesenchyme에 존재하는 다른 ECM 기판에 판 explants. 또한, explants는 cel의 행동에 액세스 할 3 차원 매트릭스에 포함 할 수 있습니다이 맥락에서인가요. 이 explant 분석은 마이그레이션을 조절하고 수정할 수 있습니다 본질적인 및 외부 신호를 분석 할 두개골 mesenchyme 행동에 대한 유전 및 약리 조작의 효과 분석에 수정할 수있는 것입니다. 예를 들어, 우리는 Hectd1 돌연변이 두개골 mesenchyme ¹⁵ 이상 세포 행동에 과잉 분비 Hsp90의 역할을 분별하기 위해 우리의 연구에서이 분석을 활용. 이 실험에서 우리는 Hectd1 돌연변이 세포의 비정상적인 동작이 초과 세포 Hsp90 ¹⁵ 인해 있다는 것을 입증하는 Hsp90의 분비를 차단하는 안티 - Hsp90 항체와 explants, Hsp90 단백질 geldanamycin 및 DMA (디메틸 amelioride)를 처리. 비슷한 접근 방식은 pharmacologically 두개골 mesenchyme의 정상 또는 비정상적인 morphogenesis의 근간이 추가 경로를 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 분석이 완료되면 explants 및 마이그레이션 세포는 방법 호스트에 의해 분석 될 수 있습니다. 예를 들어, immunohistochemical 분석의 C이 세포 움직임에 대한 중요한 단백질의 국산화를 검토 고용 할 수. Transcriptome 분석은 또한 치료 유전자 발현에 영향을 미칠 방법을 결정하기 위해 사용될 수있다.

이 기법 중 하나 중요한 한계는 그들이 생체에서 발생하는 것처럼 세 차원의 모델 행동을하지 않는 것입니다. explants는 형광 단백질 마크 세포 구획의 표현과 함께 3 차원 매트릭스 (예 : matrigel)에 포함되어있는 프로토콜의 변경이 문제를 해결하는 데 필요한 고용 할 수있다. 이러한 수정이 수행 된 경우에도 생체에 사람들과이 전 생체 분석에서 볼 행동을 상호 연관하기 위해 추가 실험이 필요 것입니다. 다른 제한은 정적으로 중요한 데이터를 생성하기에 충분한 숫자를 생성하는 데 필요한 배아의 큰 번호가 포함됩니다. 가장 중요한 것은, 절개가 비교적 간단하다, 그것은 마스터에 연습을 필요로하지 않습니다.

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

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