Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Il mesenchima cranica subisce movimenti morfogenetici drammatici che fornisce probabilmente una forza trainante per l'elevazione delle pieghe neurali ^1,2. Qui descriviamo un semplice Ex vivo Espianto saggio per caratterizzare i comportamenti cellulari del mesenchima cranica durante neurulazione. Questo saggio ha numerose applicazioni tra cui essere suscettibili di manipolazioni farmacologiche e analisi di imaging dal vivo.

Il sistema nervoso centrale è derivato dalla piastra neurale che subisce una serie di movimenti morfogenetici complessi causando formazione del tubo neurale in un processo noto come neurulazione. Durante neurulazione, morfogenesi del mesenchima che sta alla base della placca neurale si crede di guidare neurale elevazione volte. Il mesenchima cranica è costituito dal mesoderma parassiale e cellule della cresta neurale. Le cellule del mesenchima forma cranica un reticolo porosa composta di cellule stellate sagomati ed interconnessi matrice extracellulare (ECM) filamenti che supportano le pieghe neurali. Durante neurulazione, il mesenchima cranica subisce riarrangiamenti stereotipati con conseguente sua espansione e questi movimenti si ritiene di fornire una forza trainante per neurale elevazione volte. Tuttavia, i percorsi e comportamenti cellulari che guidano la morfogenesi cranica mesenchima ancora poco studiato. Le interazioni tra l'ECM e le cellule dei cranici thes mesenchima sono alla base deicella E comportamenti. Qui descriviamo un semplice saggio ex vivo espianto ideato per caratterizzare i comportamenti di queste cellule. Questo saggio è modificabile a manipolazioni farmacologiche di sezionare la segnalazione vie di degradazione coinvolte e le analisi di imaging dal vivo per caratterizzare ulteriormente il comportamento di queste cellule. Presentiamo un esperimento rappresentativo dimostrare l'utilità di questo test nel caratterizzare le proprietà migratorie del mesenchima cranica su una varietà di componenti ECM.

Chiusura del tubo neurale nella regione craniale si verifica tra 8,5 giorno embrionale (E8.5) e 9,5 in embrione di topo. La mancata per chiudere correttamente il tubo neurale nei risultati testa in anencefalia, un difetto comune di nascita strutturale negli esseri umani ed è incompatibile con la vita. Le forze che guidano cefalica chiusura del tubo neurale sono generati sia dal tessuto neurale stessa e l'epidermide circostante e mesenchima ^3. In particolare, l'espansione del mesenchima cranica è ritenuta essenziale per la elevazione della neurale cranica ^1,2 pieghe. Mesenchima cranica è ricco di proteine ​​ECM in particolare proteine ​​glicosilate come proteoglicani condroitin solfato di eparina, solfati e ^4-8 ialuronato.

Diversamente l'embrione di pollo in cui cellule della cresta neurale emigrare dal tubo neurale dorsale dopo la chiusura del tubo neurale, la cresta neurale nel topo migra al tempo stesso che le pieghe neurali iniziano a rISE (dopo la fase 5 somite). Così durante neurulazione nel topo, il mesenchima cranica è composto di cellule derivate dalla cresta neurale e il mesoderma parassiale. Cresta neurale e le popolazioni mesoderma parassiale sono indotti in momenti diversi dello sviluppo, localizzati in posizioni diverse l'embrione e si sviluppano in diverse strutture ^9,10. Il mesoderma parassiale nasce dalla stria primitiva e migra verso la regione anteriore dell'embrione alla base della piastra neurale presuntiva. La cresta neurale è indotta a livello della giunzione della piastra neurale e ectoderma epidermico, subisce un epitelio di transizione mesenchima e delamina appena prima neurale elevazione volte nell'embrione roditore. Cellule della cresta neurale migrano lungo i percorsi stereotipati del mesoderma parassiale subectodermal al arco branchiale, fronto-nasale e mesenchima perioculare. Il mesoderma parassiale contribuiranno a realizzare alcune delle ossa della volta cranica e dei muscoli della faccia e che thcresta neurale e contribuirà ad altre ossa del cranio e del viso, oltre ai nervi cranici ^9-11. Il mesoderma parassiale e lignaggi della cresta neurale può essere differenzialmente segnato dalla Mesp1-cre-cre e Wnt1 linee di topi transgenici, rispettivamente ^9.

Il ruolo essenziale del mesenchima cranica in chiusura del tubo neurale è stato dedotto da esperimenti in cui il trattamento degli embrioni nei roditori con ECM interrompere agenti come ialuronidasi, condroitinasi ABC, heparitinase o diazo-oxo-norleucina (DON) in fase di chiusura del tubo neurale neurulazione compromessa ^{7, 12-14.} In questi esperimenti, l'analisi istologica di sezioni statiche seguito neurulazione rivelato dysmorphogeneis collegati al cranica mesenchima ^7,12-14. Tuttavia, poiché l'agente teratogeno avuto accesso a molteplici tessuti, rimane da determinare se il mesenchima cranica è realmente il tessuto bersaglio. A sostegno della conclusione che questo tessutoè essenziale per neurulazione, il mesenchima cranica appare anomalo su analisi istologiche in alcuni mutanti di topo con exencefalia ^15-17. Ancora, nella maggior parte dei casi, l'effetto della mutazione sul comportamento cellulare del mesenchima cranica non è stato affrontato.

Abbiamo pensato ad un saggio espianto ex vivo per esaminare direttamente la conseguenza di mutazione genetica o manipolazione farmacologica sul comportamento delle cellule mesenchimali cranici ^15. Questo dosaggio è simile a quello pubblicato da Tzahor et al 2003 per vedere il potenziale di differenziazione del mesenchima che sta alla base cranica le rombomeri ¹⁸ tranne che hanno modificato la dissezione espianto di studiare le proprietà migratori di popolazioni più anteriori di mesenchima che sono alla base del cranio neurale anteriore piastra. Il nostro metodo è anche una variante di saggi espianti eseguiti in embrione di pollo di analizzare il comportamento migratorio della cresta neurale con key differenze. Preparazioni precedenti hanno espiantato la cresta neurale o il mesoderma parassiale più posteriore ^19,20. Inoltre, nel corso neurale elevazione volte nell'embrione di pollo, la cresta neurale non è ancora emigrato dal tubo neurale dorsale e quindi espianti prese il mesoderma parassiale anteriore non contiene cellule della cresta neurale. Nel nostro saggio, espianti mesenchima craniche costituiti mesoderma parassiale, cresta neurale e ectoderma di superficie sono preparati e piastrate su un substrato. Manipolazione sperimentale compreso isolamento di espianti di mutanti genetici, placcatura espianti di ECM diverso o trattamenti farmacologici può essere eseguita. Cellule migrano dal espianto e la distanza, il numero e il comportamento possono essere analizzati e confrontati tra i gruppi di trattamento. Inoltre, questa preparazione è modificabile per analisi di migrazione cellulare mediante tecniche di imaging vivi. Dopo l'esperimento migrazione, espianti può essere fissato e sottoposto ad analisi immunoistochimica per pelliccether chiarire l'effetto dei trattamenti. Nel complesso, il protocollo qui presentato è un semplice test ex vivo per studiare il comportamento del mesenchima cranica. Come un esperimento rappresentativo, utilizziamo questo test per esaminare la migrazione di mesenchima cranica su diversi substrati extracellulari.

1. Preparazione di piatti Cultura ECM rivestiti o coprioggetto

1. Preparare soluzione di ECM sciogliendo substrato ECM in PBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline, Invitrogen, # 14040-133). Filtrare con un filtro a siringa 0,2 millimetri (VWR, # 28.145-495) e congelare in aliquote a -80 ° C.
2. Diluire soluzione di ECM in PBS alla concentrazione desiderata. Per MaxGel, diluire in DMEM (Dulbecco Modified Aquila americano, Invitrogen, # 11995-065).
3. Se immunofluorescenza verrà effettuata, sterilizzare 12 vetrini circolari mm (VWR, # 89015-724) per immersione in etanolo e lasciare asciugare all'aria. Questo dovrebbe essere fatto all'interno della cappa laminare sterile. Se immunofluorescenza non verrà eseguita passare al punto 1.5.
4. Posto sterilizzato coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (Corning, # 3526).
5. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di substrato diluito ad ogni pozzetto della piastra da 24 pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 3 ore.
6. Aspirare dalla soluzione ECM e lavare threvolte posta in PBS.
7. Aspirare off PBS e utilizzare immediatamente o avvolti in parafilm e conservati a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.

2. Preparazione di strumenti di dissezione

Piastre Sylgard con carbone aggiunto sono preparati secondo il protocollo del fabbricante. Lo sfondo nero resistente di queste targhe fornisce il supporto per appuntare giù l'embrione e il colore offre un buon contrasto che facilita la visualizzazione dell'embrione traslucido.

1. Per preparare piatti pesare direttamente in un tri-versare becher su un equilibrio di parte 150 g Un liquido 15 g Parte B e 1 g di polvere di carbone (Strumenti di precisione del mondo, # SYLG184). Mescolare con un bastoncino di legno ghiacciolo o abbassalingua. Versare in vetro o plastica, 100 piatti cm. Utilizzare una piccola torcia butano tenuto circa 10 a 12 pollici sopra i piatti a bruciare eventuali bolle. Coperchi posto sulle piastre e lasciate riposare per almeno 24 ore per impostare.
2. Per preparare strumenti di dissezione inserire un perno Minutien (0,1 millimetri diameter) in un supporto del perno (Belle Strumenti Scientific, # # 26.002-10 e 26.018-17, rispettivamente) in alternativa 26 aghi calibro (BD, # 309.597) piegate ad angolo retto con l'ausilio di pinze possono essere utilizzati come strumenti di dissezione. Affilato Student Dumont N ° 5 Pinza (Strumenti Scienza Fine, # 91150-20) con una pietra da affilatura (Belle Strumenti Scientifici, # 29008-22).
3. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo prima dell'uso.

3. Raccolta di embrioni

1. Eutanasia il mouse a tempo in stato di gravidanza a 8.5 dopo coitum giorni secondo le norme di utilizzo degli animali della commissione e rimuovere utero.
2. Utero Mettere in un piatto di plastica Petri con PBS sterile.
3. Lavare utero una volta con PBS sterile.
4. Sotto un microscopio dissezione rimuovere con attenzione embrione da deciduas utilizzando un paio di pinze.
5. Rimuovere membrane extraembrionali e salvare per la genotipizzazione, se necessario.
6. Embrione Fase contando somiti. Le tappe ideali per rendere espianti di analizzare cellulare behAvior durante neurale elevazione volte sarebbe tra i 6 e 10 tappe somite quando le pieghe neurali hanno appena iniziato a elevare e prima della morfogenesi principale del mesenchima cranica avviene.
7. Lavare embrione in PBS. Mettere in un piatto nero Sylgard con DMEM che non contiene rosso fenolo (Invitrogen, # 21063-029). Rimuovere le membrane extraembrionali e salvare per la genotipizzazione, se necessario.

4. Preparazione di espianti

1. Ridefinire il microscopio con l'ingrandimento più alto possibile sopra la regione della testa dell'embrione.
2. Fare tagli con un ago dissezione in ogni mano. Impiegare un ago per tenere il tessuto in posizione e l'altra di effettuare tagli.
3. Tagliare la testa dell'embrione anteriore ai rombomeri.
4. Tagliare lungo la linea mediana per tagliare in due la testa in due metà uguali.
5. Tagliare intorno ai margini esterni della testa e linea mediana. Questi tagli rimuoverà la cresta premigratory e ectoderma di superficie al confine esterno ela piastra precordale sulla linea mediana. Il tessuto rimanente sarà l'espianto e la migrazione conterrà la cresta neurale cranica, mesoderma parassiale e ectoderma di superficie.
6. Quando il tessuto viene tagliato, rimuovere detriti sezionato dal piatto utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Questo modo si evita di confondere il espianto con i detriti sezionato.
7. Lavare delicatamente l'espianto da dell'uso lasciare equilibrare su e giù con una pipetta 20 pl punta e Pipetman. In questo modo rimuovere le cellule vagamente collegate e prevenire i bordi frastagliati sugli espianti.
8. Cautela raccogliere ogni espianto in circa 10 ml di liquido utilizzando una punta di pipetta 20 microlitri e Pipetman e posto al centro della cultura rivestito bene.
9. Aggiungere 20 ml di mezzo di coltura addizionato con 15% FBS a coprire l'espianto.
10. Piastra posto in un incubatore umidificato tissutale (5% CO _2, 37 ° C) per 1-2 ore per consentire l'espianto di allegare al fondo del piatto. Guarda periodicamente per assicurare che l'espianto non asciugareout.
11. Quando l'espianto è collegato, con cura aggiungere a ciascun pozzetto 250 microlitri DMEM supplementato con FBS 10% che è stato riscaldato a 37 ° C a bagnomaria. Una volta espianti hanno attaccato che non si muovano quando la piastra è leggermente scosso al microscopio.
12. Ritorno piatto al tessuto cultura incubatore.
13. Dopo 24 ore, gli espianti saranno saldamente e le cellule cominceranno a emigrare. In questo momento agenti farmacologici possono essere aggiunte al mezzo.
14. 48 ore dopo la placcatura, le cellule si sono migrati dalle espianti. La distanza di migrazione possono essere visualizzati e creata l'immagine. Noi di solito fermare la cultura a questo punto da espianti cominciano a mostrare segni di vitalità diminuita con più lunghe incubazioni. Un colorante vitale come arancio acridina o trypan blu può anche essere utilizzato per controllare la vitalità della espianto.
15. A questo punto le immagini possono essere acquisite per documentare la distanza e il numero di cellule che migrano dal espianto. In alternativa, se espianti sono state piastrate su vetrini,essi possono essere fissati e analisi immunoistochimiche effettuate per visualizzare proteine ​​di interesse.

Passaggi critici nel protocollo

1. Tagliare espianti di circa la stessa dimensione.
2. Cancella tutti i detriti dissezione la piastra dissezione come si sta dissezione, per evitare detriti confondere con il tessuto desiderato espiantato.
3. Quando espianti placcatura in pozzi o su vetrini essere sicuri di mettere goccia di media con espianto nel centro di bene.
4. Lasciare espianto tempo sufficiente per collegare prima inondando il pozzo con i media.
5. Condizioni di trattamento dovrebbero essere standardizzati per ogni substrato di prova e agente farmacologico utilizzato.
6. Due espianti può essere fatto da ciascun embrione (uno a sinistra e uno da destra del tubo neurale).
7. Quando la verifica della migrazione di cellule di linee mutanti di topo in diverse condizioni sperimentali, mettere un espianto mutante nel gruppo di controllo e l'altro nel gruppo trattato.

Risoluzione dei problemi

1. Se espianti non riescono a fissare, aumentare il tempo a disposizione per il fissaggio. Nella nostra esperienza, circa la metà degli espianti non attaccare e grandi espianti aderire in modo più efficiente.
2. Se espianti attribuiscono alla periferia del pozzo che sarà difficile immagine. Assicurarsi di posizionare espianti nel centro del pozzo.
3. Idealmente espianti saranno all'incirca le stesse dimensioni. Tuttavia, differenze nelle dimensioni espianto può essere corretto usando il diametro degli espianti come fattore di correzione quando quanitating migrazioni di cellule da espianti.
4. In caso di contaminazione assicurarsi sterili condizioni di lavoro sono in uso. Tutti gli strumenti e le superfici di lavoro devono essere sterilizzati con etanolo 70%. Pipette e scatole di Petri devono essere nuovi e sterile.
5. Se espianti sono sempre persi durante la dissezione, periodicamente rimuovere i detriti per evitare di perdere espianto.
6. Padroneggiare la dissezione richiede molto tempo e ci vuole pratica. Optimal di ingrandimento, strumenti di dissezione taglienti e guida in aghi.

La comparsa di cellule migranti da espianti mesenchima craniche è mostrato in Figura 2. Abbiamo testato migrazione su vari substrati ECM che sono presenti nel mesenchima cranica durante neurulazione comprese fibronectina (100 mg / ml, Sigma # F1141), laminina (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (diluizione 1:500 in DMEM ; Sigma # E0282) e acido ialuronico (1 mg / ml, Sigma, # 53.747). Cellule non riescono a migrare dal espianto ECM quando non è presente (dati non mostrati) e tutti i substrati testati migrazione supportato delle cellule. Sia la forma e le dimensioni delle cellule che migrano dagli espianti dipende dal substrato. Questo è previsto da precedenti studi dimostrano che le forze meccaniche generate dall'interazione delle cellule con diversa ECM influenzano sia la forma e le proprietà migratorie delle cellule ^21.

Figura 1. Preparazione di espianti. (A) Per preparare espianti, E8.5 embrioni sono sezionati da deciduas e tessuti extraembrionali. (B) teste embrioni vengono sezionati dal corpo anteriore ai rombomeri. Espianti sono preparato rimuovendo il tessuto dalla linea mediana ed i bordi esterni della testa per rimuovere la piastra precordale alla linea mediana e la cresta neurale e premigratory ectoderma di superficie al confine, rispettivamente. (C) espianti sono preparati tagliando via il tessuto dai bordi della linea mediana ed esterna della testa per rimuovere la piastra precordale alla linea mediana e la cresta neurale e premigratory ectoderma di superficie dei bordi. (D) espianti sono posti in un piccolo volume di supporti sui piatti ECM rivestite / coprioggetti e fatte attaccare prima l'aggiunta di più supporti.

Figura 2. Espianti di migrazione di cellule mesenchimali cranici da espianti placcati su supporti diversi. Sono state piastrate su fibronectina, laminina, MaxGel ECM o acido ialuronico e fotografato dopo 48 ore di cultura. Bar Dimensioni = 200 mm.

Il metodo applicato qui fornisce un saggio potente per esaminare il comportamento delle cellule mesenchimali del cranio. Oltre alle analisi statiche qui presentate, vivono esperimenti di imaging in campo chiaro o in combinazione con l'espressione di proteine ​​marcate con GFP può essere impiegato per esaminare i comportamenti delle cellule in tempo reale mentre migrano dal espianto. Per gli esperimenti di imaging dal vivo, espianti possono essere etichettati con DiI o per differenziare migrazione di cresta neurale dal mesoderma parassiale, ROSA-YFP; Mesp1-creazione o ROSA-YFP; Wnt1-cre o altre linee transgeniche potrebbero essere utilizzati. Craniche mesenchima-ECM interazioni possono essere esaminati anche utilizzando questo test espianto. Qui si espianti piastra su substrati diversi ECM che sono presenti nel mesenchima cranica per mostrare che le cellule migrano su queste per diversi gradi e che la ECM influenza la morfologia delle cellule. Inoltre, espianti possono essere incorporati in una matrice tridimensionale di accedere i comportamenti di cells in questo contesto. Questo saggio espianto è modificabile per l'analisi degli effetti di manipolazioni genetiche e farmacologiche sui comportamenti mesenchima cranici per analizzare segnali intrinseci ed estrinseci che possono regolare e modificare la migrazione. Per esempio, abbiamo utilizzato questo test nei nostri studi di discernere il ruolo di un eccesso di secrezione di Hsp90 nei comportamenti anomali cellulari in Hectd1 mesenchima mutante cranica ^15. In questi esperimenti, si espianti trattati con anticorpo anti-Hsp90, Hsp90, proteine ​​geldanamicina e DMA (amelioride dimetil) per bloccare la secrezione di Hsp90 per dimostrare che il comportamento anomalo di Hectd1 cellule mutanti è dovuta all'eccesso extracellulare Hsp90 ^15. Approcci simili potrebbe essere utilizzato per analizzare farmacologicamente percorsi aggiuntivi sottostanti morfogenesi normale o anormale del mesenchima cranica. Una volta che l'analisi è stata completata, espianti e cellule migranti possono essere analizzati da una serie di metodi. Per esempio, c analisi immunoistochimicaun essere impiegato per esaminare localizzazione di proteine ​​critiche per i movimenti cellulari. Analisi trascrittomo potrebbe anche essere impiegato per determinare come trattamenti influenzare l'espressione genica.

Una significativa limitazione di questa tecnica è che non comportamenti modello in tre dimensioni come sarebbero verificano in vivo. Modifica del protocollo in cui sono incorporati in un espianti matrice tridimensionale (ad esempio matrigel) insieme con l'espressione di proteine ​​fluorescenti compartimenti cellulari marcati potrebbe essere impiegato necessaria per affrontare questo problema. Anche se queste sono state eseguite, ulteriori esperimenti per correlare i comportamenti osservati in questo saggio ex vivo con quelli in vivo sarebbe necessario. Altre limitazioni includono il numero di embrioni necessari per generare numeri sufficienti per generare dati staticamente significativi. La cosa più importante, la dissezione è relativamente semplice, richiede pratica per padroneggiare.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo lavoro è supportato da R01-HD058629 per IEZ