Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

이 문서에서는 높은 처리량 방법은 항원 제시 세포의 특정 수용체​​를 타겟에 더 이상 사용할 수 polyanhydride의 nanoparticles의 표면에 oligosaccharides과 첨부 파일의 합성을 위해 제공됩니다.

이러한 자료 디자인, 나노 테크놀로지, 화학, 면역학 등의 분야를 포함 Transdisciplinary 방법은 이성적 효능 백신 캐리어를 디자인하는 데 활용해야합니다. Nanoparticle 기반 플랫폼은 백신에게 immunogenicity ^1을 향상시킬 수있는 백신 항원의 지속성을 연장하실 수 있습니다. 여러 생분해성 폴리머는 백신 배달 차량 ^1로 연구되어, 특히 polyanhydride 입자는 안정적인 단백질 항원의 지속적인 출시를 제공하고 항원 제시 세포를 활성화하고 면역 반응에게 ^2-12를 조절하는 능력을 증명하고있다.

이러한 백신 운반선의 분자 설계 폴리머 속성의 합리적인 선택뿐만 아니라 적절한 타겟팅 대리인의 법인을 통합해야합니다. 리간드와 작용 입자를 대상으로 높은 처리량을 자동으로 지어낸 다양한 R을 공부하는 능력을 향상시킬 수있는 강력한 도구입니다속성의 엔지와 재현성 백신 전달 장치의 디자인으로 이어질 것입니다.

면역 세포의 특정 수용체에 의해 인식되는 수있는 리간드를 타겟팅 이외는 ^10,11,13 C 형 렉틴 수용체 (CLRs가)에 탄수화물이 존재 인식 패턴 인식 수용체 (PRRs)입니다 변조 및 재단사 면역 반응을 보여줘왔다 병원균의 표면. CLRs 통해 면역 세포의 자극은 항원과 더욱 T 세포 활성화 ^14,15위한 후속 프레 젠 테이션의 향상된 내면화을 허용합니다. 따라서 탄수화물 분자는 면역 반응의 연구에 중요한 역할을하지만, 이러한 biomolecules의 사용은 종종 구조적으로 잘 정의되고 순수한 탄수화물의 가용성의 부족을 앓고. 솔루션 위상 반응을 반복을 바탕으로 자동화 플랫폼은 크게 낮은 B를 사용하여 이러한 synthetically 도전 분자의 신속하고 제어 합성을 활성화할 수 있습니다전통적인 고체 상 ^16,17 방법보다 블록 수량 uilding.

여기에 우리는 이러한 중간 정화를위한 fluorous 고체 상 추출과 mannose 기반 타겟팅 리간드로서 oligosaccharides의 자동화 솔루션 상 합성을위한 프로토콜을보고합니다. 탄수화물 기반 타겟팅 요원이되기 위해 자동화된 방법을 개발 후, 우리는 이전에 ¹⁰ 설명된대로 LabVIEW에서 운영하는 자동화된 로봇 세트를 고용 polyanhydride nanoparticles의 표면에 그들의 부착을위한 방법을 설명합니다. 탄수화물과 표면 작용화는 CLRs에게 ^10,11을 대상으로하고 발굴 다중 파라메 트릭 시스템과 관련된 복잡 아주 가치 (그림 1A)이 될에게 제조 방법의 처리량 증가에 효험을 보이지 않고있다.

1. 높은 처리량 탄수화물 합성

1. 이전 dimannoside의 자동화 합성, 적절한 보호 설탕 기증자, 일반적으로 trichloroacetimidate 및 수용체 주로 알케닐 fluorous 알코올에이 벤치 위에 합성됩니다.
2. 프로그램 dimannoside의 자동 합성을 위해 쓰여집니다. 기본적인 자동화된 절차의 도식 표현은 그림 2에 표시됩니다. 프로그램에서, 그것은 발기인의 추가하기 전에 기증자와 수용체의 혼합물은 최소 30 분 동안 흔들 것을 보장합니다.
3. 합성 기증자, 수용체 및 trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate의 솔루션은 dichloromethane으로 만들어집니다. 톨루엔과 dichloromethane는 글리코 실화 반응을 위해 가장 자주 사용됩니다.
4. 또한, 80 % 메탄올 및 100 %의 메탄올에 임시 보호 그룹 deprotection위한 시약의 솔루션을 준비합니다.
5. 프로그램의 시작하기 전에되도록 그 relat방에있는 필자 습도는 자동화 챔버 30 % 이하이다. 높은 습도는 글리코 실화 반응에 대한 해로운 것입니다.
6. 프로그램이 시작되면 로봇 팔이 순차적으로 반응 유리병에 기증자와 수용체의 솔루션을 전송합니다. 그런 다음 혼합물은 30 분 동안 흔들 수 있습니다.
7. 로봇 팔이 혼합물로 trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate의 0.2-0.3 등가물를 전송 다음으로, 일반적으로 상온에서 -20와 같은 낮은 온도 ° C는 획득 수 있지만. 반응 혼합물은 30 분 동안 흔들 수 있습니다.
8. 30 분 후 반응이 멈춘 작은 나누어지는는 반응 진행을 모니터링하기 위해 제거됩니다. 완료되지 않은 경우, 반응은 계속 수 있으며 궁극적으로 필요한 시간을 수정할 수 있습니다.
9. 반응이 완료되면 반응 혼합물은 정화를 위해 C ₈ F _17-수정된 실리카 겔을 포함 fluorous 고체 상 추출 (FSPE) 카트리지로 전송됩니다.
10. 장바구니산등성이 먼저 비 fluorous 분수를 떼어 버리려고 80 % 메탄올 - 물 혼합 (8 ML)로 씻어 있습니다.
11. 그러면 카트리지는 원하는 fluorous 태그가 추가된 제품을 얻기 위해 100 % 메탄올로 씻어 있습니다. 추가적인 정화가 필요한 경우 컴퓨터가 정지하고 반응 생성물 (들)은 추가적인 방법으로 정화를 위해 제거할 수 있습니다.
12. 정화 사이클 후 로봇 팔이 반응 유리병에 나트륨 methoxide을 dispenses. 반응은 2 시간 동안 흔들 수 있습니다. 완료되지 않은 경우, 반응은 다시 긴 기간 동안 계속 수 있으며 궁극적으로 필요한 프로그램의 시간은 수정할 수 있습니다.
13. 반응의 완료 후, 제품은 FSPE에 의해 정화되어 후 잔류 수분을 제거하는 증발 다음에 무수 톨루엔에 용해에 노출.
14. 원하는 체인 길이 대상 분자에 대해 얻은 것입 때까지 그 다음주기가 (6 단계 13 일부터) 반복됩니다.
15. 자동화에서 얻은 보호되는 제품은 일입니다도중에 더 정화와 완전히 같은 핵 자기 공명 (NMR) 분광법과 같은 기술이 특징. 그것은 보통 폭발성 수소 가스와 팔라듐을 포함하기 때문에 최종 목표 분자의 완전한 deprotection은 (모든 남아있는 보호 그룹의 삭제) 후 원칙적으로 자동화 플랫폼 밖 완료됩니다. 최종 deprotection 단계는 자동화 플랫폼 밖 벤치 위에 실시되었다. 첫 번째 단계는 카르복실산로 제작 알데히드의 산화 다음 fluorous 태그에 이중 결합의 온존 분해했습니다. 제품은 칼럼 크로마 토그래피에 의해 정화되었다. 마지막 단계는 팔라듐 - 촉매의 첨가에 의한 벤질 에테르 그룹 deprotection했습니다. 제품은 순수하게 최종 제품을 얻기 위해 팔라듐 없애 celite 패드 통과되었다.

2. 높은 처리량 Nanoparticle 표면 작용화

1. 높은 처리량 고분자 합성과 nanoparticle의 제조는 동일한 PR에 따라 수행됩니다otocol과 로보트가 피터슨 외 ^19에 기술된 설정합니다. 입자 제조에 사용되는 공중 합체 시스템이 sebacic 산성 (SA)과 1,6 - 비스 (파라 carboxyphenoxy) 헥산 (CPH) 및 1,8 - 비스 (를 기준으로합니다 패러 carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) 및 CPH. 활용 로봇 증착 장치의 개략도 표현은 그림 1B에 표시됩니다.
2. nanoparticle 제조 따라 nanoparticle 라이브러리와 튜브를 포함하는 홀더는 선형 액추에이터 무대 reattached 있습니다.
3. polyanhydride 입자의 표면에 탄수화물의 첨부 파일이 들어 연속 2 반응으로 구성된 아민 - 카르복실산 커플링 반응 ²⁰ 수행됩니다.
4. 첫 번째 반응 들어, 첫 번째 프로그램 주사기 펌프에 주사기를 1 - 에​​틸 -3 - (3 - 디메틸) 10 등가물 (eq.) (입자 표면의 평균 어금니 카르복실산 농도의 등가물)으로 가득합니다-CArbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDC)와 10 EQ. 수용액에서의 에틸렌의 두 번째 프로그램 주사기 펌프의 주사기는 12 EQ와 함께로드되는 동안. 수용액에서 N-hydroxysuccinimide (보건국)의.
5. LabVIEW 프로그램을 사용하면, 시약의 현탁액은 nanoparticle 라이브러리 *로 입금됩니다.
6. 다음 각 예제는 sonicated됩니다 (40 Hz에서 30들)과 튜브 홀더는 로봇 플랫폼에서 분리됩니다.
7. Nanoparticle의 현탁액은 4 ° C.에 일정한 회전 구 H에 **에 대한 incubated있다
8. 반응 시간이 완료되면 튜브는 centrifuged (5 분 12,000 XG)와 두 세척 단계를 수행할 수있는 로봇 스테이션에 반환됩니다.
9. 두 번째 주사기 펌프의 주사기는 차가운 물로 채워진 상태에서 세척 들어, 주사기는 비어와 최초의 프로그램 가능한 주사기 펌프에 로드된 남아 있습니다. 각 튜브의 표면에 뜨는는 빈 주사기와 보조 펌프의 예금 찬물에​​ 철회된다.
10. 나노의 균질화2.6 단계에서 설명한대로 입자 현탁액이 수행됩니다. 튜브 그때 centrifuged됩니다 (5 분 12,000 XG)와 단계 2.9에 설명된 두 번째 세척 단계가 수행됩니다.
11. 두 번째 반응의 경우, 두 증착 단계가 사용됩니다. 최초의 증착 단계에서, 12 EQ. EDC 중 한 펌프 및 12 개의 EQ와 함께로드됩니다. 의 보건국은 보조 펌프와 함께로드됩니다.
12. 두 번째 증착 단계는 10 EQ를 포함합니다. 첫 번째와 두 번째 펌프 (즉, 갈락토 오스, 유당 또는 디 - mannose) *** 10 EQ와 삼분의 일 펌프에 대한 구체적인 saccharide니다. 의 glycolic 산 (제어로 사용 ****).
13. 4 ° C.에서 단계 2.6에 설명된 지속적인 회전 구 H 위해 incubated로 Nanoparticle의 현탁액이 균질하고 있습니다
14. 반응 시간이 완료되면 단계 2.8, 2.9 및 2.10에 설명한 바와 같이, 세탁 단계가 수행됩니다.
15. 작용 nanoparticle 라이브러리 후 적어도 2 시간 동안 건조 진공 챔버에 배치됩니다.
16. 작용 nanoparticles 그런 다음 문자 위치X 선 광전자 분광법 각각 표면 조성과 saccharide의 농도를 결정하는 높은 처리량 페놀 - 황산 분석하여 ized. 전자 현미경 및 동적 광 산란을 스캐닝하는 것은 입자 크기, 크기 분포 및 표면 요금을 결정하기 위해 활용됩니다.

주 : * 증착 볼륨이 각 튜브에 포함된 nanoparticles의 질량에 따라 다릅니다.
첫 번째와 두 번째 반응을위한 ** 반응 시간은 최종 saccharide 농도를 조정하도록 변경할 수 있습니다.
*** 각 saccharide이 원하는 그룹에 따라 테스트 튜브로 입금됩니다.
deprotected saccharides 이미 nanoparticle의 표면에 대한 부착을 허용 covalently 연결이 분자를 가지고 있기 때문에 **** 탄수화물의 첨부 파일이 연구에 사용된 구체적인 반응의 경우, glycolic 산은 링커 컨트롤로 사용됩니다.

3. 대표 결과

ful그림 2에 표시된 요 보호 dimannoside은 자동화 플랫폼을 사용하여 합성되었다. 합성 화합물은 용매로 CDCl _3을 사용 VXR 400 MHz의 분광계에 ¹ H NMR에 의해 특징되었습니다. NMR 스펙트럼은 그림 3에 표시됩니다.

polyanhydride의 높은 처리량 nanoparticle의 제조 및 작용화을 이용하는 것은 본 설명한 nanoparticles, dimannose, 락토 오스 및 갈락토 오스의 첨부 파일이 성공적으로 ^{10, 11} 실시되었습니다. 이 설정을 사용하여 최적의 반응 조건 (즉, 반응 온도 및 시간) 원하는 nanoparticle의 작용화 조직 형태를 달성하는 확인되었다. 반응이 4 시에 실시되었을 때 ° C ~ 대신 상온의, nanoparticle의 집합의 감소가 SEM에서 관찰되었다 (데이터가 표시되지 않음). 디 - mannose이나 자중 CPH의 nanoparticles : 표 1은 작용 50:50 CPTEG의 특성을 대표하는 결과를 보여줍니다4에서 합성 유당, ° C. 데이터 작용화로 인해 평균 nanoparticle 직경의 작은 증가를 나타냅니다. 비 작용 nanoparticles는 약 부정적인 제타 잠재력을 가지고 있지만. -20 MV는 작용 입자 nanoparticle 표면의 성공 작용화 보여주 긍정 제타 잠재적인 가치를 보여주었다. 락토 오스 및 디-mannose는 모두 중립 설탕되지만 에틸렌 무료로 아민 그룹 saccharides를 연결 활용 링커가 긍정적인 제타 전위의 책임 수도 디아민.

반응 시간은 nanoparticles의 최종 형태와 달성 설탕 첨부의 학위를 모두 영향을 미칠 수있는 또 다른 변수입니다. 반응 시간을 조정하여, nanoparticles 표면에 부착된 최종 설탕 농도는 그림 4A와 같이 제어할 수 있습니다. 예상했던대로 50:50 CPTEG의 표면에 dimannose의 농도 : CPH는 nanoparticles가 함께 증가반응의 전체 시간과 18 시간 후 최대에 도달했습니다. 24 시간 총 반응 시간과 기능화 Nanoparticles은 마우스 뼈 - 골수 파생 돌기 세포 (DC가)에 CLRs을 타겟팅하는 능력을 평가하는 데 사용되었다. 유동세포계측법 두 CL 수용체 (즉, CIRE (CD209, DC-로그인) 및 mannose 수용체 (CD206)) 이외의 작용과 자극 후, 그리고 유당 및 DI-mannose 작용 nanoparticles (그림 4B)의 표현을 평가하는 데 사용되었다. 세포가 락토 오스 및 디-mannose 작용 nanoparticles 모두 함께 자극했을 때 효과적인 타겟팅을 나타내는 것입니다 두 수용체의 높은 표현은, 얻은 것입니다. 그러나, 디-mannose-작용 입자 공부했다 수용체이 리간드의 특이성을 나타내는 표현의 높은 수준을 보여주었다.

표 1. Nanoparticle 특성화. 비 작용과 작용이 유사 탄성 광 산란 및 제타 잠재력 측정을 특징으로했다. 입자 크기 데이터는 평균 값이 ± 세 독립적인 실험에서 수집한 동적 광 산란 데이터의 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 제타 잠재적인 데이터는 평균 값이 ± SD 세 독립적인 신호를 나타냅니다. CPH nanoparticle의 표면 :​​ 제타 전위의 기호의 변화는 설탕 50:50 CPTEG에 효율적으로 복합했습니다 보여줍니다.

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그림 1. 탄수화물 polyanhydride의 nanoparticles의 작용화 및 설명 높은 처리량 방식으로 설계할 수있는 작용 nanoparticle 라이브러리의 예제를 통해 추구하는 접근법 (A) 그래픽 표현. (B) 자동 증착 장치의 도식 표현는 (i) 세 NE 1,000 펌프로 구성되어 입자 작용화, 활용, (ii) 본 로봇 무대는 두 액츄에이터 (Zaber)에 의해 통합 : X 방향의 움직임을위한 하나의 다른 두 인접한 랙에은 (튜브 및 cuvettes에 적합한) 세 액츄에이터, 각 방향에 대해 하나 (X, Y 및 Z)으로 구성된과 (3) 두 번째 로봇 무대, Y 방향의 운동입니다. 펌프 다섯 액츄에이터의 총 시리즈에 연결되어 있습니다. 발전소 펌프는 LabVIEW 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에 의해 운영됩니다. 이 그림은 규모에 없습니다.arge.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 자동의 그래픽 표현은 예로 mannose를 사용하여 탄수화물의 합성을 반복.

그림 3. 보호 dimannoside의 ¹ H NMR.

그림 4. () saccharide의 nanoparticle의 표면 농도에 대한 반응 시간의 영향. 표시된 데이터에 50:50 CPTEG : CPH의 nanoparticles는 서로 다른 반응 시간에 dimannose으로 기능화되었으며 반응은 4 시에 진행되었습니다 ° C. 두 개의 독립적인 작용화 실험의 평균 및 표준 오류가 표시됩니다. (B) 유당과 디 - mannose 작용 nanoparticles취득 표현에 비해 CPH nanoparticles : 뼈 작용 50:50 CPTEG로 자극 후이 두 마커의 향상된 표현에 의해 증명으로 골수 파생 돌기 세포에 효과적으로 대상 DC-기호 (CIRE, CD209)와 mannose 수용체 (CD206) 비 작용 입자로.

면역 세포에 직접 nanoparticle의 상호 작용에 에이전트를 대상으로 같은 탄수화물의 약효는 이전 ^{10, 11을} 입증되었습니다. 우리 실험실에서 이전 연구는이를 더욱 T 세포 활성화 ^{10, 11} 중요할 수도 면역 세포의 활성을 향상 polyanhydride의 nanoparticles에 연결된 특정 설탕은 항원 제시 세포 (APCs)에 다른 CLRs를 타겟팅할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 몇 가지 매개 변수 - 같은 polyanhydride 화학, 크기, 설탕이나 표면 설탕의 종류 밀도 - 필요 최적화되어야하므로 이러한 다중 파라메 트릭 시스템과 관련된 복잡 발굴에 제조 방법에 처리량을 증대 등을 대상으로 최적의 달성을 위해 큰 도움이 될 것입니다. 또한, biosensing, 효소 고정 및 foodb의 검출을 포함하여 연구의 다른 관련 분야에 큰 가치를 지닌 경우 작용 nanoparticles의 사용오른의 병원체.

탄수화물 설명하는 높은 처리량 합성을 활용함으로써, 탄수화물 분자의 재현성 합성의 과​​제는 해결할 수 있습니다. 동일한 설탕 자동 병렬 반응은 필요에 따라 자료의 큰 양을 생산할 수있다. 설탕과 glycoconjugates의 알려진 역할은 급속하게 확장하고있다. 그럼에도 불구하고, 여러 프로세스에서 탄수화물 분자 메커니즘, 예를 들어 신호 전달 경로 또는 세포 인식 프로세스 ^21의 이해, 구조적으로 잘 정의된 saccharides의 간편하고 저렴한 가용성에 의존합니다. 정확한 체인 확장을위한 다양한 히드록실 그룹의 반응도를 제어하기위한 보호 / deprotection 전략은 설탕 합성을위한 주요 필수 조건이지만, 지루하고 시간이 많이 소요됩니다. Oligonucleotides 및 oligopeptides은 정기적으로하고 효율적으로 자동 신디사이저 ^{22, 23을} 사용하여 합성된다. 고체 상 합성기는 애바입니다 빌딩 블록의 예 : 대형 침 (단계 커플링 당 5-20 등가물), 반응 진행의 손쉬운 모니터링의 부족, 그리고 사용되는 고체 상 수지의 고유의 다양성 : 올리 고당 합성 ^24,하지만 고통 심각한 단점의 용 ilable . 새로운 솔루션 상 자동화 플랫폼은 그러나이 소중한 빌딩 블록의 단지 2-3 상응하는 필요합니다. 이 플랫폼에서는 이러한 알케닐 fluorous 그룹으로 fluorous 태그의 다양한 아닌 fluorous 화합물 ^{18, 25, 26에서} 쉽게 중간 제품을 정화 (FSPE) fluorous 고체 상 추출을 가능하게합니다. 여기에 그림과 같이 그러나, 이러한 태그는 솔루션 상 글리코 실화 및 표준 유기 용제의 deprotection 반응을 배제하지 않습니다. 또한, 다른 고체 상 자동 합성기와 달리,이 새로운 플랫폼은 질량 분석법 (MS)와 모든 단계에서 박막 크로마 토그래피 (T​​LC)와 같은 표준 반응 모니터링 전략을 수 있습니다.

NLBP는 cofounder이며 탄수화물 회사 LuCella Biosciences 주식 회사의 지분을 보유하고

저자는 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령을 감사드립니다 (권한 부여 # W81XWH-10-1-0806)와 재정 지원을위한 국립 보건원 (권한 부여 # U19 AI091031-01 및 권한 부여 # 1R01GM090280)는 것이다. BN은 화학 및 생물 공학 Balloun 교수를 인정하고 NLBP은 학제간 공학 윌킨슨의 교수로 인정한다. 우리는 nanoparticle의 작용화 실험을 수행하는 그녀의 도움 줄리아 벨라 감사드립니다.