الإنتاجية العالية لتخليق الكربوهيدرات وFunctionalization النانوية Polyanhydride

في هذه المقالة، ويقدم وسيلة إنتاجية عالية لتركيب يغوساكاريدس وتمسكهم سطح النانوية polyanhydride لاستخدامها مرة أخرى في استهداف مستقبلات معينة على خلايا مقدمة للمستضد.

النهج المتعدد التخصصات التي تشمل مجالات مثل تصميم المواد، وتكنولوجيا النانو، والكيمياء، وعلم المناعة لديها لاستخدامها في تصميم بعقلانية فعال لقاحات الناقلين. يمكن للجسيمات متناهية الصغر القائمة على منصات إطالة استمرار مستضدات اللقاحات، التي يمكن أن تحسن لقاح استمناع ^1. وقد تم دراسة العديد من البوليمرات القابلة للتحلل وسائل إيصالها لقاح ^1؛ على وجه الخصوص، والجسيمات polyanhydride أثبتت قدرتها على توفير إطلاق مستمرة من مولدات المضادات البروتين مستقرة والى تنشيط خلايا مستضد تقديم وتعدل الاستجابات المناعية ^2-12.

التصميم الجزيئي لهذه الناقلات لقاح يحتاج إلى دمج الاختيار الرشيد لخصائص البوليمر، فضلا عن دمج المناسبة وكلاء الاستهداف. ارتفاع تلفيق الإنتاجية الآلي من استهداف يغاندس والجسيمات functionalized هو أداة قوية من شأنها أن تعزز القدرة على دراسة واسعة صأنج من الخصائص، وسوف تؤدي إلى تصميم استنساخه تسليم الأجهزة لقاح.

وقد تبين إضافة استهداف يغاندس قادرة على أن تعترف بها مستقبلات معينة على خلايا المناعة لتعديل والاستجابات المناعية خياط ^10،11،13 مستقبلات كتين C-نوع (CLRs) هي مستقبلات نمط الاعتراف (PRRs) التي تعترف الكربوهيدرات موجودة على سطح من مسببات الأمراض. تنشيط الخلايا المناعية عن طريق CLRs يسمح لاستيعاب المعزز للمستضد وعرض لاحقة لمزيد من تنشيط الخلايا T ^14،15. ولذلك، جزيئات الكربوهيدرات تلعب دورا هاما في دراسة الاستجابات المناعية، ولكن استخدام هذه الجزيئات الحيوية غالبا ما يعاني من عدم توافر هيكليا واضحة المعالم والكربوهيدرات النقية. يمكن لمنصة التشغيل الآلي على أساس حل تكرارية المرحلة ردود الفعل تمكن من التجميع السريع وتسيطر هذه الجزيئات تحديا صناعيا باستخدام ب أقل من ذلك بكثيرuilding كميات كتلة صلبة من الأساليب التقليدية في المرحلة ^16،17.

هنا نقدم تقريرا بروتوكول لتركيب حل المرحلة الآلي من يغوساكاريدس مثل المانوز القائم على استهداف يغاندس مع استخراج الصلبة المرحلة fluorous لتنقية وسيطة. بعد تطوير طرق الآلي لجعل وكيل الكربوهيدرات القائم على استهداف، ونحن تصف أساليب لتعلقهم على سطح polyanhydride النانوية توظيف مجموعة الآلي الروبوت حتى تشغلها ابفيف كما هو موضح سابقا ^10. وقد أظهرت functionalization السطح مع الكربوهيدرات فعالية في استهداف CLRs ^10،11 وزيادة الإنتاجية للأسلوب تلفيق لكشف النقاب عن التعقيدات المرتبطة نظام متعدد حدودي لن تكون ذات قيمة كبيرة (الشكل 1A).

1. الإنتاجية العالية الكربوهيدرات التجميعي

1. وقد تم تجميع قبل تركيب الآلي من dimannoside، إحدى الجهات المانحة السكر محمية بشكل مناسب، trichloroacetimidate عادة، والمتقبلة، وذلك أساسا على الكحول alkenyl fluorous، على أعلى مقاعد البدلاء.
2. يتم كتابة برنامج لتركيب الآلي من dimannoside. ويرد التمثيل التخطيطي الداخلي الآلي الأساسية في الشكل 2. في البرنامج، ويتم التأكد من أن قبل إضافة المروج، ويحرك الخليط من الجهات المانحة ومتقبل ما لا يقل عن 30 دقيقة.
3. تصنع الحلول للمتقبل الاصطناعية، والجهات المانحة وtrimethylsilyltrifluoromethanesulfonate في ثنائي كلورو ميثان. وتستخدم التولوين وثنائي كلورو ميثان في معظم الأحيان عن ردود الفعل ارتباط بالغليكوزيل.
4. أيضا، وإعداد الحلول من الكواشف لdeprotection من جماعات حماية مؤقتة في الميثانول 80٪ والميثانول بنسبة 100٪.
5. قبل بدء البرنامج، تأكد من أن تعصبإيف الرطوبة في الغرفة هو 30٪ أو أقل في غرفة التشغيل الآلي. الرطوبة العالية هو ضار للتفاعلات ارتباط بالغليكوزيل.
6. بمجرد بدء تشغيل البرنامج، الذراع الالية نقل الحلول من الجهات المانحة ومتقبل في قارورة رد فعل متسلسل. ثم يحرك الخليط لمدة 30 دقيقة.
7. المقبل الذراع الالية نقل 0،2-0،3 حكمه من trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate إلى الخليط، وعادة في درجة حرارة الغرفة على الرغم من انخفاض درجات الحرارة مثل -20 درجة يمكن أن يتحقق C. يحرك خليط التفاعل لمدة 30 دقيقة.
8. بعد 30 دقيقة، يتم إيقاف رد فعل وإزالة قسامة صغير لرصد التقدم المحرز رد فعل. إذا لم يكتمل بعد، ويمكن أن يستمر رد الفعل، وفي نهاية المطاف يمكن تعديل الوقت المطلوب.
9. مرة واحدة في رد فعل غير كاملة، ويتم نقل خليط رد فعل على fluorous خراطيش المرحلة الصلبة (FSPE) التي تحتوي على استخراج C ₈ F ₁₇ معدلة وهلام السيليكا لتنقية.
10. العربةتغسل 1 التلال مع خليط الميثانول في المياه بنسبة 80٪ (8 مل) للتخلص من جزء غير fluorous.
11. ثم تغسل مع خراطيش الميثانول بنسبة 100٪ للحصول على المنتج المطلوب fluorous الموسومة. إذا كان المطلوب تنقية إضافية، يمكن أن توقف آلة والمنتج رد فعل (ق) إزالة لتنقية من قبل وسائل إضافية.
12. بعد دورة تنقية، الذراع الالية يوزع ميثوكسيد الصوديوم في قارورة رد فعل. وأثار رد فعل لمدة 2 ساعة. إذا لم يكتمل بعد، ويمكن مرة أخرى أن يستمر رد فعل لفترة أطول وبالتالي يمكن تعديل الوقت مبرمجة مطلوب.
13. بعد الانتهاء من رد الفعل، ويتم تنقيته من المنتج عن طريق FSPE وتعرض بعد ذلك إلى انحلال في التولوين اللامائية تليها تبخر لإزالة المياه المتبقية.
14. ثم تتكرر الدورة (من الخطوة 6 إلى 13) حتى يتم الحصول على طول السلسلة المطلوب لهذا الجزيء الهدف.
15. المنتج المحمية التي تم الحصول عليها من أتمتة هو الEN تنقية أخرى، وتتميز بشكل كامل بواسطة تقنيات مثل التحليل الطيفي المغناطيسي النووي (NMR) صدى. اكتمال ثم deprotection كاملة (إزالة جميع الفئات الباقية حماية) من جزيء الهدف النهائي خارج منصة التشغيل الآلي كقاعدة لأنه عادة ما ينطوي المتفجرة غاز الهيدروجين والبلاديوم. تم تنفيذ الخطوة النهائية deprotection خارجا على أعلى مقاعد البدلاء خارج منصة التشغيل الآلي. كانت الخطوة الأولى ozonolysis من الرابطة المزدوجة في علامة fluorous تليها أكسدة الألدهيد المنتجة لحمض الكربوكسيلية. تمت تنقية المنتج من قبل اللوني العمود. وكانت الخطوة النهائية deprotection الجماعات الأثير بنزيل بواسطة البلاديوم المحفز الهدرجة. تم تمرير المنتج من خلال لوحة celite للتخلص من البلاديوم للحصول على المنتج النهائي محض.

2. الإنتاجية العالية Functionalization الجسيمات النانوية السطح

1. ويتم عالية الإنتاجية تركيب البوليمر وتصنيع جسيمات متناهية الصغر في أعقاب العلاقات العامة نفسهضبط otocol والروبوتية حتى وصفها بيترسن وآخرون ^19. وتستند أنظمة كوبوليمر تستخدم لتصنيع الجسيمات على حامض sebacic (SA) و 1،6 مكرر (شبه carboxyphenoxy) الهكسين (CPH)، و 1،8 مكرر ( شبه carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane (CPTEG) وCPH. ويرد التمثيل التخطيطي لجهاز ترسب الروبوتية المستخدمة في الشكل 1B.
2. بعد تلفيق جسيمات متناهية الصغر، وإعادة ربط حامل تحتوي على أنابيب مع مكتبة جسيمات متناهية الصغر إلى مرحلة خطي المحرك.
3. لمرفق من الكربوهيدرات على سطح جزيئات polyanhydride، يتم تنفيذ اقتران حامض ^أمين-20 الكربوكسيلية رد فعل تتكون من اثنين من ردود الفعل على التوالي.
4. لأول رد فعل، يتم تعبئة حقنة في مضخة محقنة برمجة 1 مع 10 حكمه (ما يعادل) (المعادل من متوسط ​​المولي تركيز حمض الكربوكسيلية على سطح الجسيمات) من 1 إيثيل-3-(3-dimethylaminopropyl) عن ولاية كاليفورنياهيدروكلوريد rbodiimide (EDC) ومكافئ 10. من الإيثيلنديامين في محلول مائي، في حين يتم تحميل حقنة في مضخة محقنة برمجة المركز الثاني برصيد 12 مكافئ. من N-hydroxysuccinimide (NHS) في محلول مائي.
5. باستخدام برنامج ابفيف، تترسب في تعليق كاشف جسيمات متناهية الصغر * مكتبة.
6. المقبل، وsonicated كل عينة (30 ق في 40 هرتز)، ويتم فصل صاحب أنبوب من منصة الروبوت.
7. يتم تحضين تعليق جسيمات متناهية الصغر ل** ح 9 مع دوران مستمر في درجة مئوية 4
8. بعد الانتهاء من فترة رد الفعل، وطرد الأنابيب (12000 XG لمدة 5 دقائق)، وعاد إلى محطة روبوتية لتنفيذ خطوات غسل اثنين.
9. لغسل، حقنة تبقى فارغة ومحملة في مضخة محقنة برمجة الاولى، بينما يتم تعبئة حقنة في مضخة الحقنة الثانية مع الماء البارد. يتم سحب طاف في كل أنبوب إلى المحقنة الفارغة والودائع 2 مضخة الماء البارد.
10. تجانس نانويتم تنفيذ تعليق الجسيمات كما هو موضح في الخطوة 2.6. وطرد بعد ذلك الأنابيب (12000 XG لمدة 5 دقائق) ويتم تنفيذ خطوة الغسيل 2 كما هو موضح في الخطوة 2.9.
11. عن رد الفعل الثاني، وتستخدم الخطوات ترسب اثنين. في الخطوة ترسيب 1، 12 مكافئ. من EDC يتم تحميلها مع مضخة واحدة ومكافئ 12. تم تحميلها من NHS مع المضخة الثانية.
12. الخطوة الثانية تشمل 10 ترسيب مكافئ. من السكريد محددة بشأن مضخات الأولى والثانية (أي الجالاكتوز واللاكتوز أو دي المانوز-) *** ومضخة المركز الثالث برصيد 10 مكافئ. من حمض الجليكوليك (استخدامها لمكافحة ****).
13. والمتجانس تعليق جسيمات متناهية الصغر كما هو موضح في الخطوة 2.6 وحضنت لمدة 9 ساعات مع دوران مستمر في درجة مئوية 4
14. بعد الانتهاء من الوقت من رد فعل، يتم تنفيذ خطوة الغسيل كما هو موضح في خطوات 2.8، 2.9 و 2.10.
15. ثم يتم وضع مكتبة functionalized جسيمات متناهية الصغر في دائرة الفراغ لتجف لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
16. النانوية functionalized من ثم حرفأوتوماتيكية بواسطة الأشعة السينية الضوئية الطيفي وعالية الإنتاجية فحص حامض الكبريتيك، الفينول لتحديد تكوين سطح وتركيز السكريد على التوالي. المجهر الإلكتروني، وتناثر ضوء دينامية تستخدم لتحديد حجم الجسيمات، وحجم التوزيع، والمسؤول عن السطح.

ملاحظات: حجم ترسب * تختلف مع كتلة النانوية الواردة في كل أنبوب.
ويمكن ان تتغير على أوقات رد الفعل ** لردود الفعل الأولى والثانية لضبط تركيز السكريد النهائي.
*** يترسب كل السكريد في أنابيب الاختبار اعتمادا على المجموعة المطلوبة.
**** لردة فعل معينة المعتمدة في هذه الدراسة على الحجز على الكربوهيدرات، ويتم استخدام حمض الجليكوليك كعنصر تحكم رابط منذ ساتشاريديس deprotected لديها بالفعل هذا الجزيء مرتبطة تساهميا، والذي يسمح للمزيد من التعلق على سطح جسيمات متناهية الصغر.

3. ممثل النتائج

وفولتم تصنيعه dimannoside لاي المحمية هو مبين في الشكل رقم 2 باستخدام منصة التشغيل الآلي. وقد تميزت مجمع توليفها من قبل الرنين المغناطيسي H ¹ في مطياف VXR 400 ميغاهرتز باستخدام CDCl ₃ كمذيب. يظهر طيف الرنين المغناطيسي النووي في الشكل 3.

الاستفادة من تصنيع جزيئات النانو عالية الإنتاجية وfunctionalization من polyanhydride النانوية الموصوفة هنا، وقد تم تنفيذ الحجز على اللاكتوز، dimannose والجالاكتوز بنجاح ^{10 و 11.} تستخدم هذه المجموعة حتى تم تحديد الظروف المثلى رد فعل (على سبيل المثال، درجة حرارة التفاعل والوقت) لتحقيق المطلوب functionalization جسيمات متناهية الصغر والصرف. عندما تم تنفيذ رد فعل بها في 4 درجات مئوية بدلا من درجة حرارة الغرفة، لوحظ وجود انخفاض في تجميع جسيمات متناهية الصغر من قبل ووزارة شؤون المرأة (لا تظهر البيانات). ويبين الجدول 1 النتائج ممثل توصيف CPTEG 50:50 functionalized: النانوية CPH إما مع المانوز-دي أواللاكتوز، وتوليفها في 4 درجات مئوية. وتشير البيانات إلى زيادة طفيفة في قطر جسيمات متناهية الصغر في المتوسط ​​نظرا لfunctionalization. في حين كان لجزيئات غير functionalized احتمال زيتا سلبية تقريبا. -20 بالسيارات، وأظهرت الجزيئات functionalized قيمة زيتا الإيجابية المحتملة، مما يدل على functionalization الناجح لسطح جسيمات متناهية الصغر. اللاكتوز ودي المانوز وكلاهما من السكريات محايد، ولكن جماعات أمين خال من الاثيلين ديامين رابط تستخدم لنعلق ساتشاريديس قد تكون مسؤولة من إمكانات زيتا إيجابي.

وقت رد فعل آخر هو متغير التي يمكن أن تؤثر على كل من التشكل النهائي للجزيئات ودرجة التعلق السكر التي تحققت. عن طريق ضبط وقت رد الفعل، ويمكن التحكم في تركيز السكر النهائية التي تعلق على سطح النانوية كما هو مبين في الشكل 4A. كما كان متوقعا، وتركيز dimannose على سطح CPTEG 50:50: CPH النانوية مع زيادةبلغ إجمالي الوقت من رد فعل وبحد أقصى بعد 18 ساعة. واستخدمت النانوية functionalized مع الوقت رد فعل مجموع 24 ساعة لتقييم قدرتها على استهداف CLRs على الماوس نقي العظم الخلايا الجذعية المشتقة (DCS). وقد استخدم التدفق الخلوي لتقييم التعبير عن مستقبلات CL 2 (أي سيري (CD209، DC-SIGN) ومستقبلات المانوز (CD206)) بعد التحفيز مع functionalized غير، واللاكتوز وثنائي المانوز النانوية functionalized (الشكل 4B). تم الحصول على أعلى تعبير عن كل من المستقبلات، وهو يدل على الاستهداف الفعال، عندما تم تحفيز الخلايا مع كل من اللاكتوز و DI-المانوز النانوية functionalized. ومع ذلك، أظهرت DI-المانوز-functionalized الجزيئات إلى مستوى أعلى من التعبير يشير إلى خصوصية هذه يجند لمستقبلات التي تمت دراستها.

الجدول رقم 1. توصيف جسيمات متناهية الصغر. واتسمت غير functionalized وfunctionalized من تشتت الضوء شبه مطاطة والقياسات زيتا المحتملة. بيانات حجم الجسيمات تمثل قيمة المتوسط ​​± الانحراف المعياري (SD) من البيانات الديناميكي تشتت الضوء التي تم جمعها في ثلاث تجارب مستقلة. بيانات زيتا المحتملة تمثل قيمة متوسط ​​± التنمية المستدامة من ثلاث قراءات مستقلة. تغيير في مؤشر على احتمال زيتا يدل على أن السكر كان مترافق كفاءة لCPTEG 50:50: CPH سطح جسيمات متناهية الصغر.

= "/ files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
الشكل 1: (أ) تمثيل رسومي للنهج السعي مع functionalization الكربوهيدرات النانوية polyanhydride ومثالا للمكتبات functionalized جسيمات متناهية الصغر التي يمكن أن تكون مصممة مع النهج الإنتاجية العالية وصفها. (ب) تمثيل تخطيطي للجهاز ترسيب الآلي المستخدمة لfunctionalization جسيم، والذي يتألف من (ط) ثلاث مضخات NE 1000، (الثاني) مرحلة الروبوتية متكاملة من قبل اثنين من المحركات (Zaber): واحد للحركة في اتجاه x والآخر للحركة في اتجاه y، (الثالث) في مرحلة ثانية الروبوتية مع اثنين من الرفوف المجاورة (المناسبة للأنابيب وcuvettes)، ويتألف من ثلاثة المحركات، واحد لكل اتجاه (X، Y، و Z). يتم توصيل المضخات وما مجموعه خمسة المحركات في سلسلة. ويتم تشغيل المحركات والمضخات عن طريق الكمبيوتر باستخدام ابفيف البرمجيات. هذا المخطط ليس على نطاق واسع.arge.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

الشكل 2. تمثيل رسومي للآلية التكرارية توليف الكربوهيدرات باستخدام المانوز كمثال على ذلك.

الشكل 3. ¹ H NMR من dimannoside المحمية.

الشكل 4. (A) تأثير وقت رد الفعل على تركيز سطح جسيمات متناهية الصغر من السكريد. في البيانات التي تظهر، 50:50 CPTEG: تم functionalized النانوية CPH مع dimannose في بعض الأحيان رد فعل مختلفة، ونفذ فيها التفاعل عند 4 درجات مئوية. ويظهر الخطأ متوسط ​​ومستوى تجربتين functionalization مستقل. (ب) واللاكتوز دي المانوز-النانوية functionalizedمستقبلات بفعالية الهدف DC-SIGN (سيري، CD209) والمانوز (CD206) في نخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية، كما ظهر من التعبير تعزيز هذه العلامات اثنين بعد التحفيز مع CPTEG 50:50 functionalized: النانوية CPH بالمقارنة مع التعبير التي تم الحصول عليها مع المنظمات غير functionalized الجزيئات.

وقد فعالية من الكربوهيدرات كما تستهدف وكلاء لتفاعلات جسيمات متناهية الصغر مباشرة إلى الخلايا المناعية أثبتت سابقا ^{10 و 11.} وقد أظهرت البحوث السابقة في مختبراتنا أن السكريات محددة ملحقة النانوية polyanhydride قادرة على استهداف CLRs مختلفة على الخلايا مستضد تقديم (ناقلات الجنود المدرعة)، وبالتالي تعزيز وتفعيل الخلايا المناعية التي قد تكون هامة لمزيد من تنشيط الخلايا T ^{10 و 11.} ومع ذلك، لتحقيق أقصى قدر من استهداف العديد من هذه المعايير، مثل الكيمياء polyanhydride والحجم ونوع من السكر أو السكر سطح الكثافة بحاجة إلى أن يكون الأمثل، وبالتالي زيادة الإنتاجية في أسلوب تلفيق لكشف النقاب عن التعقيدات المرتبطة مثل نظام متعدد حدودي 1 وسوف تكون ذات قيمة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الجسيمات النانوية functionalized إذا قيمة كبيرة إلى المجالات الأخرى ذات الصلة من البحوث، بما في ذلك biosensing، الشلل الانزيم، والكشف عن foodbمسببات الأمراض أورني.

من خلال الاستفادة من وصف الإنتاجية العالية التوليف من الكربوهيدرات، ويمكن التخفيف من التحديات في تركيب استنساخه من جزيئات الكربوهيدرات. يمكن أن ردود الفعل الموازي الآلي من السكر نفسه إنتاج كميات أكبر من المواد حسب الحاجة. أدوار معروف من السكريات وغليكوكونجوغاتيس تتوسع بسرعة. ومع ذلك، فهم الآليات الجزيئية من الكربوهيدرات في العديد من العمليات، مثل مسارات نقل الإشارة أو عمليات اعتراف الخلوية ^21، ويعتمد على توافر سهلة ورخيصة من ساتشاريديس محددة جيدا من الناحية الهيكلية. حماية / deprotection استراتيجيات للسيطرة على التفاعل من مجموعات الهيدروكسيل المختلفة لتمديد سلسلة دقيق هي شرط مسبق رئيسي لتخليق السكر، ولكنها مملة ومضيعة للوقت. يتم بانتظام وكفاءة وتوليفها [أليغنوكليوتيد] oligopeptides باستخدام المزج الآلي ^{22، 23.} المزج مرحلة الصلبة افا ilable لتخليق oligosaccharide ^24، لكنها تعاني من بعض العيوب الخطيرة: على سبيل المثال، تجاوزات كبيرة من اللبنات (5-20 مكافئات لكل اقتران خطوة)، وعدم وجود رصد سهلة للتقدم رد فعل، وتباين المتأصلة في راتنجات الصلبة مرحلة المستخدمة . جديد منصة التشغيل الآلي حل المرحلة، ولكن يتطلب سوى 2 إلى 3 حكمه من هذه اللبنات الثمينة. في هذا البرنامج مجموعة متنوعة من العلامات fluorous، مثل مجموعة fluorous alkenyl، تمكن fluorous الصلبة مرحلة الاستخراج (FSPE) لتنقية المنتجات الوسيطة بسهولة من غير fluorous مركبات ^{18، 25، 26.} ومع ذلك، كما هو موضح هنا، هذه العلامات لا تمنع حل المرحلة ارتباط بالغليكوزيل وردود الفعل deprotection في المذيبات العضوية القياسية. أيضا، على عكس أي المزج الصلبة مرحلة الآلي، وهذه المنصة الجديدة يسمح معيار استراتيجيات الرصد رد فعل مثل مطياف الكتلة (MS) ورقيقة اللوني طبقة (TLC) في أي مرحلة.

NLBP هو أحد مؤسسي، ويحمل في رأس مال شركة الكربوهيدرات LuCella العلوم البيولوجية، وشركة

فإن الكتاب أود أن أشكر للبحوث الطبية للقوات المسلحة الامريكية والعتاد القيادة (جرانت # W81XWH-10-1-0806)، والمعاهد الوطنية للصحة (جرانت # U19 AI091031-01 وغرانت # 1R01GM090280) للحصول على الدعم المالي. BN يعترف Balloun الأستاذية في الهندسة الكيميائية والبيولوجية وNLBP يعترف الأستاذية ويلكنسون من التخصصات الهندسية. نشكر جوليا فيلا على مساعدتها في إجراء تجارب functionalization جسيمات متناهية الصغر.