형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한 절차 C. 엘레간스 종자는 고가의 정렬 장비를 필요로하지 않는다는 설명이다. 이 접근법은 많은 inducible에 적용할 수 있습니다 C. 엘레간스 오염 물질의 약물 발견을위한 유전자 또는 biosensing.

하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 생물 학적 과정의 화학 변조기를 식별에 대한 강력한 접근 방식이다. 그러나, 세포 배양 모델을 사용하여 화면에서 확인된 많은 화합물은 종종 생체내 ^1-2에 독성이나 pharmacologically 비활성으로 볼 수 있습니다. 전체 동물 모델에서 상영하는 것은 이러한 함정을 피하는데 도움이 및 약물 개발에 대한 경로를 합리화 수 있습니다.

C. 엘레간스 잘 HTS 적합 다세포 모델 생물이다. 그것은 작은 (<1mm)과 경제적 교양과 액체에 적절하게 사용하실 수 있습니다. C.가 엘레간스 또한 약물 모드의 액션 ³ 신속하고 상세한 신분증을 허용 가장 실험적으로 다루기 쉬운 동물 모델 중 하나입니다.

우리는 culturing에 대한 프로토콜을 설명하고 C의 형광 변종을 분배 화학 라이브러리 또는 특정 유전자의 표현을 변경할 환경 오염 물질의 검출에 높은 처리량 검사 엘레간스. 발달 동기 웜의 큰 번호, 액체 문화에 재배 수확, 씻어, 그리고 정의 밀도에서 중단됩니다. 웜는 다음 연동 액체 디스펜서를 사용하여 검정, 평평한 바닥 384 잘 접시에 추가됩니다. 화학 라이브러리 또는 테스트 샘플 (예, 물, 음식, 또는 토양)에서 작은 분자는 벌레와 우물에 추가할 수 있습니다. 생체내에서 실시간 형광 강도가 형광 microplate 판독기로 측정됩니다. 이 방법은 C.에 inducible 유전자에 적용할 수 있습니다 적당한 기자 사용할 수있는 엘레간스. 많은 inducible의 스트레스와 발달 transcriptional 경로는 잘 C.에 정의되어 있습니다 엘레간스와 GFP 유전자 변형 기자의 종자는 이미 ⁴ 많은 존재합니다. 적절한 형질 기자와 함께하면, 우리의 방법은 경로의 모듈 레이터를위한 화면이나 환경 오염에 대한 강력한 바이오 센서 assays을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 C를 증명 엘레간스 문화와 분배 프로토콜은 HTS 분석과 함께 우리는 C를 모니터하기 위해 개발된 엘레간스 모자 'N'칼라 전사 인자 SKN - 1. SKN - 1과 포유류의 homologue의 Nrf2 ^5-10 산화 스트레스와 생체 이물 중 cytoprotective 유전자를 활성화해야합니다. Nrf2는 암, neurodegeneration, 그리고 만성 염증과 같은 다양한 연령과 관련된 질환에서 포유류를 보호하고 주요 chemotherapeutic 대상 ^{11-13되고있다.} 우리의 분석은 -4 SKN - 1 대상 유전자 GST ¹⁴ GFP 유전자 변형 기자를 기반으로, 이것은 글루타티온 - S transferase ⁶ 인코딩합니다. GST -4 기자도 SKN - 1을 활성화 및 아크릴 아미드와 메틸 수은과 같은 오염 물질의 ^15-16 낮은 수준을 감지하는 데 사용할 수있는 생체 이물 및 산화 화학 바이오 센서이다.

1. 박테리아 웜 음식 준비

1 일

1. 포화 E. 5 ML 추가 대장균 박테리아 OP50 문화 500 ML 끝내주는 국물은 50 μg / ML 스트렙토 마이신과 보충 37에 떨고 인큐베이터 (225 RPM) 숙박 성장 ° C.

날 2

2. 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에서 만 50 ML 튜브 및 원심 분리기 박테리아에 하루 박테리아 문화를 분할.
3. LB의 국물에서 가만히 따르다 액체 선충류의 성장 미디어 (NGM)의 10 ML 각 박테리아 펠렛을 resuspend. 박테리아를 resuspend 15 분 동안 바닥 통에 수평으로 흔들어. NGM 버퍼를 만들려면, 1 패 탈이온수 및 압력솥에 3g NaCl를 추가합니다. 55 쿨 ° C 및 주문에 다음 멸균 솔루션을 추가 : 1 M CaCl _2, 1 M MgSO _{4 개} 중 1 개 ML, 1 M의 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 25 ML 1 ML합니다.
4. 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에 박테리아 문화를 원심 분리기.
5. NGM 버퍼에서 가만히 따르다 및 박테리아 펠렛의 무게.
6. 산탄, 나누어지는 박테리아 3 ML -20 15 ML 튜브, 그리고 가게에 집중 ° C.를 resuspend하는 NGM 버퍼의 동일한 볼륨 추가

2. 대규모 C. 엘레간스 액체 문화

우리는 유전자 변형 라인을 사용 VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST - 4 : GFP : : NLS)]; vsIs33 [dop - 3 : RFP]) 2 형광 구성 운반 : SKN - 1을 모니터링하는 GFP ¹⁴ : Pgst -4를 : 활동 및 Pdop - 3 : RFP ¹⁷ 웜 번호 정상화를위한 표준으로 제공합니다.

1 일

1. 150 ML NGM 버퍼, 1.5 ML의 LB의 국물, 5 MG / ML 콜레스테롤 150 μl (에탄올)을, 100 MG / ML 스트렙토 마이신의 75 μl를 섞는다. 혼합 필터 - 소독 및 멸균 1리터 플라스크에 추가할 수 있습니다.
   참고 : NGM 버퍼에 1 % LB의 국물을 추가하는 것이 유리하고 plasticware에 고집에서 벌레를 방지하는 데 도움이 있지만,이 금액은 박테리아의 성장을 지원하기 위해 충분하지 않습니다.
2. 표준 염소산 절차 ¹⁸ 벌레를 동기화할 수 있습니다. 최대 gravid 웜 0.5 ML에이 염소산 솔루션 5 ML (3.75 ML 멸균 물 1 ML 가정용 표백제, 250 μl 10 N NaOH)과 하나의 15 ML 튜브에서 처리할 수 있습니다. 멸균 물 출시 달걀을 씻고 NGM 버퍼 10 ML 그들을 resuspend.
3. 계란 NGM 버퍼 100 배 (예, 10 ML 100 μl)의 샘플을 희석 세 별도 5 μl aliquots에 달걀의 개수를 계산합니다. 여러 200,000 (100 희석 요인이 X 2,000)의 평균 숫자는 계란의 총 수를 측정합니다.
4. NGM 버퍼와 술병에 200,000에 2,000,000 계란 추가 20 100 RPM에서 문화를 흔들 ° C.

날 2

5. 적어도 16 H 술병에 달걀을 추가한 후, 정지 웜 문화의 약 0.5 ML를 제거하는 살균 serological pipet을 사용합니다. 페트리 접시의 멸균 뚜껑에 Pipet 세 5 μl 방울. 벌레를 마비로 1~2분위한 -20 ° C의 냉장고에서 뚜껑을 놓습니다. 부화 웜의 총 수를 추정 30000 (150 ML / 5 μl) 5 μl를 여러 당 사는 부화 웜의 평균 개수를 계산합니다.
6. 냉동 OP50 세균성 문화 (프로토콜 1.6)의 튜브를 해동하고 500,000 부화 웜 당 웜 문화에 50% OP50 3 ML를 추가합니다. 20 100 RPM에서 술병을 흔들어 ° C. 웜이 대략 51 시간 L4 유충 젊은 성인으로 개발할 것입니다. 박테리아의 OD600 처음에 2.200에 대해해야합니다. 흡광도에 의해 박테리아의 양을 모니터링하여 OD 600 이하 0.900에 떨어뜨리면 더 추가합니다.

3. 웜 수집 및 분배

일 사

1. 표준 NGM의 한천 플레이트에 정지 웜 문화의 약 0.5 ML를 전송하는 살균 serological pipet을 사용합니다. 대부분의 L4 유충이나 젊은 성인되었는지 확인하기 위해 stereomicroscope있는 벌레를 볼 수 있습니다. L4 유충은 신체의 중앙에 복부 분명 자리를합니다. 청소년 약간 크고 분명 자리를 없을 것입니다.
2. 무균 50 ML 튜브에 웜 문화를 붓고하고 benchtop에서 테스트 튜브 랙에 튜브를 놓으십시오. 웜은 약 10 분 동안 정착을 허용합니다. 흡인이나 pipetting하여 표면에 뜨는를 제거합니다.
   참고 : 그들이 느린보다 L4 유충 젊은 성인을 해결하기 때문에이 단계는 안깐 계란이나 개발하지 않았 웜을 제거하는 것이 중요합니다.
3. 1 % LB의 국물 (NGM + LB) 박테리아를 제거하는 3-4 회와 NGM 버퍼와 단일 50 ML 튜브 및 세척에 모든 벌레를 수집합니다.
   참고 : 이것은 최고 30 초 500 RCF에서 벌레를 수집하고 신선한 NGM + LB 버퍼로 뜨는을 대체하여 스윙 - 양동이 원심 분리기에서 이루어집니다.
4. 세척 후, 50 ML에 + NGM와 LB 버퍼를 튜브를 작성 및 사용자 정의 벌레 분배 플라스크에 붓는다. 작은 저어 표시줄을 추가하고 벌레가 정지 계속 저어. 일 카운트세 5 μl 방울의 벌레의 전자 번호는 위에서 지적했다. 당신이 5 μl 드롭 (~ 2.5-3.0 웜 / μl) 당 12-15 벌레를 얻을 때까지 NGM + LB로 희석.
   참고 : 20 ML (60,000 웜)의 최소 분배 술병과 디스펜서 카세트 죽음의 공간을 채우기 위해 필요합니다. 각 384 잘 플레이트는 약 35,000 웜 또는 중지 웜의 11.5 ML이 필요합니다.
5. 10 μl 분배 카세트를로드하고 70 % 에탄올과 프라이밍하여 소독. 멸균 물을 마중물하여 에탄올을 씻어.
6. 단지 그 움직임을 방해하지 않고 교도소 표시줄 위에 있도록 술병에 분배 카세트의 끝에 삽입합니다. 벌레가 전체 술병에 걸쳐 중단 남아 있는지 확인합니다. 프로그램 디스펜서 2 사전 펄스 낮은 속도로 분배합니다. 프라임 및 정지 웜 중 적어도 10 ML을 실행합니다. 튜브에 정착에서 벌레를 방지하기 위해 신속하게 필요한 번호판을 입력합니다.
7. 숨 테이프로 번호판을 밀봉합니다.
8. 귀하의 분석에 적합한 온도 인큐베이터에서 흔들림 플랫폼에서 접시를 놓습니다. 접시를 쌓아하지 마십시오.

4. 형광 분석

1. 적절한 방출 및 여기 파장 (; RFP 540/25ex 590/35em GFP 485/20ex 528/20em 우리의 분석을위한 필터)와 각 우물의 형광 강도를 측정하기위한 microplate 판독기에 대상 접시를 놓습니다.
2. GFP / RFP의 비율을 계산하고 개별 치료에서 파생 형광 강도의 정확한 배 차이를 결정하는 제어 우물 (활성화 화합물 제외)의 수치로 정상화.

5. 대표 결과 :

우리 SKN - 1 검정은 chromosomally 통합 듀얼 기자 변형 (VP596)를 사용합니다. 그림 1에서와 같이, 웜의 숫자가 잘 적절 볼륨에 상관 있습니다. 뿐만 아니라 당 그림 2A와 2B, 총 GFP 및 RFP 형광을 표시하는 것은 우물에서 384 잘 접시에 잘 걸쳐 매우 재현할 수 있습니다. 384 우물에 걸쳐 RFP : GFP 형광은 선형 Pdop - 3 상호는 :으로 취소 유발 Pgst - 4 그림 2C에 표시됩니다. : 다양성을 줄이기 위해 RFP 기자 : GFP / RFP의 비율로 표현하면, 형광은 Pdop - 3의 능력을 보여주는 384 잘 접시 (2A에 2D 그림에서 변이 계수를 비교)에 걸쳐 우물에서 잘 고도로 재현할됩니다. 그림 3과 RFP에 GFP의 상대의 유도에 표시된 SKN - 1 생체 이물 활성화가 (38 μm의 juglone) 강력하고 384 잘 접시에 걸쳐 고도로 재현할 수있다.

그림 1. 볼륨 대 벌레 수시키지. 웜 약 2/μl로 희석하고 stereomicroscope와 함께 수동으로 계산을위한 24 잘 접시에 적절했다. N 볼륨 당 = 8 웰스.

그림 2. 384 잘 접시에 적절 웜 총 형광 다시 재현할 수 있습니다. 웜가 약 2.5/μl 30 μl에 희석되었습니다 것은 384 자 판 매 자로 적절했다. 모든 웰스의 GFP (A)와 RFP (B) 형광 9 % 이하의 유사 계수를했다. (C) GFP 형광은 매우 RFP 형광을 서로 관련됩니다. (D) RFP에 GFP의 비율을 계산하면 6% 아래 편차의 계수를 감소 (A, B, 및 D) 고체 라인 수단을 표시하고 깨진 라인이 3 개의 표준 편차 평균 위 또는 아래를 나타냅니다.

. Pgst - 4 그림 3 활성화 : GFP는 강력하고 일관성이다. 약 75 L4 벌레가 384 잘 접시와 38 μm의의 juglone의 모든 우물에 적절했다하는 것은 다른 모든 항목에 추가되었습니다. GFP 및 RFP 형광은 부화 21 H 후에 측정되었다. 말은 상대 형광 모든 컨트롤의 비율 (1.0)와 juglone 웰스 (8.9)은 고체 라인으로 표시됩니다. 컨트롤 위에 3 개의 표준 편차 뜻과 의미 juglone 아래 깨진 라인으로 표시됩니다.

우리는 culturing위한 방법을 제시하고 유전자 변형 nematodes 많은 숫자를 분배. culturing 벌레에 사용되는 장비는 분자 복제를 수행 실험실을위한 표준이며, 액체 처리 및 형광 장비 microplates 많은 숫자를 처리 실험실에 대한 표준입니다. 라이브 C. 다수의 분배의 다른 방법 엘레간스 장비 ¹⁹ 정렬 비싼 입자가 필요합니다. Pgst - 4 : GFP 분석은 뚜껑 'N'칼라 전사 요소의 작은 분자 변조기를위한 화면으로, 환경 및 식품 시료 ^14,16의 생체 이물 및 산화제 오염 물질을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 강력한 inducible 유전자 변형 GFP 기자는 경로 및 환경 자극 ⁴ 넓은 범위에서 사용할 수 있으며, 따라서 우리의 방법은 여러 경로의 개발 모듈 레이터에 적용되어야하며 오염 물질의 광범위한 스펙트럼을 감지합니다.

C. 엘레간스 transgenes은 Caenorhabditis 유전학 센터 (미네소타, 미네 아 폴리스 대학, MN)에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH R21 부여 KS로 NS0667678 - 01에 의해 지원되었다. 모든 저자는 수집, 분석 및 데이터 해석에 참가했습니다. CKL, KS 및 KPC는 원고를 작성하고 수정에 참여했습니다.