High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe von C. elegans Stämme, fluoreszierenden Reporter-Proteinen wird beschrieben, dass keine teuren Sortieranlagen. Dieser Ansatz kann auf zahlreiche induzierbaren angewendet werden C. elegans Gene für die Wirkstoffforschung oder Biosensorik von Schadstoffen.

High-Throughput-Screening (HTS) ist ein leistungsstarkes Konzept zur Identifizierung von chemischen Modulatoren der biologischen Prozessen. Allerdings sind viele Verbindungen in Bildschirmen mit Zellkultur-Modellen identifiziert oft, dass sie giftig oder pharmakologisch inaktiv in vivo ^1-2. Screening in ganz Tiermodelle können zur Vermeidung dieser Gefahren und optimieren den Weg zur Entwicklung von Medikamenten.

C. elegans ist ein vielzelligen Organismus-Modell auch für HTS geeignet. Es ist klein (<1 mm) und kann wirtschaftlich gezüchtet werden und abgefüllt in Flüssigkeiten. C. elegans ist auch einer der experimentell handhabbar Tiermodelle erlauben eine schnelle und detaillierte Identifizierung von Wirkstoffkandidaten mode-of-Aktion ^3.

Wir beschreiben ein Protokoll für die Kultivierung und Abgabe fluoreszierender Stämme von C. elegans für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken oder den Nachweis von Umweltschadstoffen, dass die Expression eines bestimmten Gens zu verändern. Eine große Anzahl von entwicklungspolitisch synchronisiert Würmer sind in flüssiger Kultur angebaut, geerntet, gewaschen und aufgehängt an einer definierten Dichte. Würmer sind dann schwarz, mit flachem Boden 384-well-Platten mit einer peristaltischen Flüssigkeitsspender aufgenommen. Kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Proben (z. B. Wasser, Nahrung oder Boden) kann in die Vertiefungen mit Würmern hinzugefügt werden. In vivo Echtzeit-Fluoreszenz-Intensität mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader gemessen. Diese Methode kann zu jeder induzierbaren Gens in C. angepasst werden elegans, für die eine geeignete Reporter zur Verfügung steht. Viele induzierbare Stress-und Entwicklungsbiologie transkriptionelle Wege sind gut in C definiert elegans und GFP transgenen Reporter-Stämme bereits für viele von ihnen ⁴ existieren. Wenn mit der entsprechenden transgenen Reporter kombiniert, können unsere Methode verwendet, um für die Bahn-Modulatoren Bildschirm oder robust Biosensor-Assays für Umweltschadstoffe zu entwickeln.

Wir zeigen unseren C. elegans Kultur und Abgabe-Protokoll mit einem HTS-Assay wir entwickelt, um die C-Monitor elegans cap 'n' Kragen Transkriptionsfaktor SKN-1. SKN-1 und seine Säuger Homolog Nrf2 aktivieren zytoprotektive Gene während der oxidative Stress und xenobiotische ^5-10. Nrf2 schützt Säugetiere aus zahlreichen altersbedingten Erkrankungen wie Krebs, Neurodegeneration und chronischen Entzündungen und ist zu einem wichtigen chemotherapeutischen Ziel ^11-13. Unser Test auf einem GFP transgenen Reporter für die SKN-1 Zielgen gst -4 ¹⁴ basiert, die kodiert für ein Glutathion-S-Transferase ^6. Die gst -4 Reporter ist auch ein Biosensor für Fremdstoff-und oxidative Chemikalien, die SKN-1 zu aktivieren und können verwendet werden, um niedrige Konzentrationen von Kontaminanten wie Acrylamid und Methyl-Quecksilber ^15-16 zu erkennen.

1. Vorbereitung der bakteriellen Wurm Lebensmittel

Tag 1

1. 5 ml gesättigte E. coli OP50 Bakterienkultur zu 500 ml Brühe Terrific mit 50 ug / ml Streptomycin ergänzt und wachsen in einem Schüttelinkubator (225 rpm) über Nacht bei 37 ° C.

Tag 2

2. Split der Nacht Bakterienkultur in zehn 50 ml-und Zentrifugenröhrchen Bakterien in einer Kühlzentrifuge bei 2.500 rcf für 20 Minuten.
3. Abdekantieren LB Brühe und resuspendieren jeder Bakterienpellet in 10 ml Flüssigkeit Nematoden Nährmedien (NGM). Schütteln Sie horizontal in einem Stockwerk Schüttler für 15 Minuten, um die Bakterien zu resuspendieren. Um NGM-Puffer, 3 g NaCl auf 1 L entionisiertem Wasser und Autoklaven. Abkühlen auf 55 ° C und in Ordnung fügen Sie die folgende sterile Lösungen: 1 ml 1 M CaCl _2, 1 ml 1 M MgSO _4, und 25 ml 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0.
4. Centrifuge die Bakterienkultur in einer Kühlzentrifuge bei 2.500 rcf für 20 Minuten.
5. Abdekantieren NGM-Puffer und wiegen das Bakterienpellet.
6. Fügen Sie dem gleichen Volumen NGM-Puffer zu den Pellets, Aliquot 3 ml Bakterien Konzentrat in 15 ml Tuben, und bei -20 ° C resuspendieren

2. Großflächige C. elegans Flüssigkultur

Wir verwenden eine transgene Linie VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) mit zwei fluoreszierenden Konstrukte: Pgst -4:: GFP ¹⁴ bis SKN-1 Monitor Aktivität und PDOP-3:: RFP ¹⁷ bis als Standard für die Wurm-Nummer Normalisierung dienen.

Tag 1

1. Mix 150 ml NGM-Puffer, 1,5 ml LB-Medium, 150 ul von 5 mg / ml Cholesterin (in Ethanol) und 75 ul 100 mg / ml Streptomycin. Filter-sterilisiert die Mischung und fügen Sie einen 1-Liter sterile Flasche.
   HINWEIS: Bei Zugabe von 1% LB Brühe auf NGM Puffer hilft, Würmer Anhaften von Glas-und Kunststoffprodukte zu verhindern, aber dieser Betrag nicht ausreicht, um das Wachstum von Bakterien zu unterstützen.
2. Synchronisieren Würmer mit dem Standard-Hypochlorit Verfahren ^18. Bis zu 0,5 ml gravid Würmer können in einem einzigen 15 ml Tube mit 5 ml Natriumhypochlorit-Lösung (3,75 ml sterilem Wasser, 1 ml Bleiche, und 250 ul 10 N NaOH) verarbeitet werden. Waschen Sie die Freigabe Eier mit sterilem Wasser und resuspendieren Sie in 10 ml NGM Puffer.
3. Verdünnen Sie eine Probe der Eier 100-fach in NGM Puffer (z. B. 100 ul in 10 ml) und zählen die Anzahl der Eier in drei separate 5 ul Aliquots. Mehrere der durchschnittlichen Anzahl von 200.000 (100 Verdünnungsfaktor x 2.000) zur Schätzung der Gesamtzahl der Eier.
4. Add 200.000 bis 2 Millionen Eier in den Kolben mit NGM-Puffer und schütteln Sie die Kultur bei 100 Umdrehungen pro Minute bei 20 ° C.

Tag 2

5. Mindestens 16 h nach der Zugabe Eier in den Kolben, eine sterile serologische Pipette ca. 0,5 ml des suspendierten Wurm Kultur zu entfernen. Pipet drei 5 ul Tropfen auf die sterile Deckel einer Petrischale. Setzen Sie den Deckel in einer -20 ° C Gefrierschrank für 1-2 Minuten, um Würmer zu lähmen. Zählen Sie die durchschnittliche Anzahl von lebenden geschlüpften Würmer pro 5 ul und dann mehrere von 30.000 (150 ml / 5 pl) auf die Gesamtzahl der geschlüpften Würmer zu schätzen.
6. Tauwetter ein Rohr aus gefrorenem OP50 Bakterienkultur (Protocol 1,6) und 3 ml 50% OP50 in die Wurm Kultur pro 500.000 geschlüpften Würmer. Schütteln Sie die Flasche mit 100 UpM bei 20 ° C. Worms wird in L4-Larven und jungen Erwachsenen in etwa 51 Stunden zu entwickeln. Die OD600 von Bakterien sollte etwa 2.200 an der Anfang sein. Überwachen Sie die Menge der Bakterien durch Absorption und fügen Sie mehr, wenn die OD 600 fällt unter 0,900.

3. Worm Sammlung und Abgabe

Tag 4

1. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette ca. 0,5 ml des suspendierten Wurm Kultur zu einem Standard NGM-Agar-Platte übertragen. Sehen Sie sich die Würmer mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass die meisten L4-Larven oder junge Erwachsene sind. L4-Larven haben einen ventralen hellen Fleck in der Mitte des Körpers. Junge Erwachsene werden etwas größer und haben keine klare Ort.
2. Gießen Sie den Wurm Kultur in sterile 50 ml Röhrchen und setzen Sie die Rohre in einem Reagenzglas Rack auf dem Labortisch. Lassen Sie die Würmer etwa 10 Minuten absetzen. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen oder Pipettieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann es wichtig sein, unhatched Eier oder Würmer, die sich nicht entwickeln sich zu entfernen, weil sie langsamer als L4-Larven und junge Erwachsene werden zu begleichen.
3. Sammeln Sie alle Würmer in einem einzigen 50 ml Tube und wäscht mit NGM-Puffer mit 1% LB-Bouillon (NGM + LB) 3-4 mal, um Bakterien zu entfernen.
   Hinweis: Dies geschieht am besten in einem Ausschwingrotor zentrifugiert durch das Sammeln von Würmern bei 500 rcf für 30 sec und Austausch der Überstand mit frischen NGM + LB-Puffer.
4. Nach dem Waschen, füllen Sie den Schlauch mit NGM + LB-Puffer auf 50 ml und gießen Sie in ein benutzerdefiniertes Wurm Verzicht Kolben. Fügen Sie einen kleinen Rührstab und rühren, damit die Würmer ausgesetzt. Graf the Anzahl von Würmern in drei 5-ul Tropfen wie oben angegeben. Verdünnen mit NGM + LB, bis Sie 12-15 Würmer pro 5 ul Tropfen (~ 2,5-3,0 Würmer / ul) zu bekommen.
   HINWEIS: Ein Minimum von etwa 20 ml (60.000 Würmer) wird benötigt, um den Totraum der Abgabe Kolben und Spender Kassette zu füllen. Jeder 384-Well-Platte benötigt etwa 35.000 Würmer oder 11,5 ml suspendiert Würmer.
5. Legen Sie eine 10 pl Dispensierkassette und sterilisieren durch Grundierung mit 70% Ethanol. Spülen Sie das Ethanol durch Grundierung mit sterilem Wasser.
6. Führen Sie das Ende des Dispensierkassette in den Kolben, so dass es direkt über dem Rührstab ohne Unterbrechung der Bewegung ist. Stellen Sie sicher, dass die Würmer das ganze Kolben suspendiert bleiben. Programm der Spender bei niedriger Drehzahl mit 2 pre-Impulse zu verzichten. Prime und führen mindestens 10 ml suspendiert Würmer. Füllen Platten so schnell um die Würmer aus, sich in den Schlauch zu verhindern benötigt.
7. Seal die Platten mit atmungsaktivem Band.
8. Legen Sie die Platten auf einem Schütteltisch in einem Brutschrank bei der geeigneten Temperatur für Ihren Test. Stapeln Sie nicht die Platten.

4. Fluoreszenz-Analyse

1. Legen Sie die Zieltafel in einem Mikroplatten-Reader, um die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Vertiefungen mit den entsprechenden Emissions-und Anregungswellenlänge (Filter für unseren Test: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em) zu messen.
2. Berechnen Sie das Verhältnis von GFP / RFP und normalisieren mit den Messwerten der Kontroll-Wells (ohne aktivierende Verbindung), um die genaue fache Differenz der Fluoreszenzintensität von einzelnen Behandlungen abgeleitet bestimmen.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Unsere SKN-1-Test verwendet eine chromosomal integrierte Dual-Reporter-Stamm (VP596). Wie in Abbildung 1 gezeigt, ist die Zahl der Würmer auch, um die Lautstärke verzichtet korreliert. Wie in 2A und 2B, insgesamt GFP und RFP-Fluoreszenz pro Vertiefung dargestellt ist in hohem Maße reproduzierbar von Brunnen zu Brunnen über eine 384-Well-Platte. : GFP-Fluoreszenz ist linear auf PDOP-3 korreliert::: RFP über 384 Wells, wie in Abbildung 2C, un-induzierte Pgst-4 gezeigt. Wenn sie als ein Verhältnis von GFP / RFP ausgedrückt, wird Fluoreszenz hoch reproduzierbare von Brunnen zu Brunnen über eine 384-Well-Platte (vgl. Variationskoeffizient aus Abbildung 2D zu 2A) demonstriert die Fähigkeit der PDOP-3:: RFP Reporter Variabilität zu reduzieren. Wie in Abbildung 3, die Induktion der GFP gegenüber RFP mit A dargestellt SKN-1-aktivierenden Xenobiotika (38 uM Juglon) ist robust und sehr gut reproduzierbare über eine 384-Well-Platte.

Abbildung 1. Anzahl der Würmer zu Volumen verzichtet. Worms wurden auf etwa 2/μl verdünnt und in eine 24-Well-Platte für die manuelle Zählung mit einem Stereomikroskop. N = 8 Vertiefungen pro Volumen.

Abbildung 2. Summe Fluoreszenz von Würmern in einer 384-Well-Platte verzichtet reproduzierbar ist. Worms wurden auf etwa 2.5/μl und 30 ul verdünnt wurde in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte verzichtet. GFP (A) und RFP (B) Fluoreszenz von allen Wells hatte einen Variationskoeffizienten unter 9%. (C) GFP-Fluoreszenz ist stark an RFP Fluoreszenz korreliert. (D) Berechnung des Verhältnisses der GFP zu RFP reduziert der Variationskoeffizient unter 6% (A, B und D) durchgezogenen Linien zeigen die Mittel und gestrichelten Linien zeigen drei Standardabweichungen über oder unter dem Mittelwert.

. Abbildung 3 Aktivierung Pgst-4:: GFP ist robust und konsistent. Etwa 75 L4 Würmer wurden in alle Wells einer 384-Well-Platte und 38 uM Juglon verzichtet war in jeder anderen Spalte hinzugefügt. GFP und RFP Fluoreszenz wurde nach 21 h Inkubation gemessen. Die mittlere relative Fluoreszenz-Verhältnisse aller Steuer (1,0) und Juglon Brunnen (8,9) sind mit durchgezogenen Linien markiert. Drei Standardabweichungen über der Kontrolle bedeuten, und unter dem Juglon meine, sind mit gestrichelten Linien markiert.

Wir stellen eine Methode zur Kultivierung und Abgabe einer großen Anzahl von transgenen Nematoden. Die Ausrüstung für die Kultivierung von Würmern verwendet wird Standard für Labors, die molekulare Klonierung und der Liquid-Handling-und Fluoreszenz-Ausstattung ist Standard für Labors Verarbeitung einer großen Anzahl von Mikroplatten. Andere Methoden der Abgabe eine große Anzahl von Live-C elegans teure Partikel Sortieranlagen ^19. Die Pgst-4:: GFP-Assay kann zum Screening niedermolekularer Modulatoren der Kragen Transkription cap 'n' Faktoren und Fremdstoff-und Oxidationsmittel Schadstoffe in Umwelt-und Lebensmittelproben ^14,16 Erkennung verwendet werden. Robust induzierbaren transgenen GFP-Reporter sind für eine breite Palette von Wegen und Reize aus der Umwelt ^{4 zur} Verfügung, und damit unsere Methode sollte für die Entwicklung von Modulatoren der vielen Wege und ein breites Spektrum von Schadstoffen zu erkennen.

C. elegans Transgene wurden von den Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN) zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 gewähren NS0667678-01 bis KS unterstützt. Alle Autoren nahmen an der Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten. CKL, KS, und KPC nahmen schriftlich und Überarbeitung des Manuskripts.