私たちの研究は、白血病、特に骨髄異形成症候群または骨髄異形成腫瘍に焦点を当てています。造血幹細胞に由来する幹細胞疾患です。これは、さまざまな血液細胞系譜、特に心臓血球の産生に関与する赤血球系に影響を及ぼします。
この系統の崩壊は、MDS患者によく見られる貧血につながる可能性があります。本稿で紹介するパイプラインは、遺伝子改変や薬物治療の際にin vitroでヒト赤芽球の効率を評価するための堅牢で簡素化された方法を可能にします。造血幹細胞は、誕生から人生の最後の瞬間まで存在しています。
私たちの体には、毎日何兆もの細胞が生産されている増殖性組織はもうありません。まだ理解すべきことがたくさんあるので、私たちはプロテオスタシスとRNA生物学に重点を置いて、健康なアミノ組織でこれらの素晴らしい細胞を研究し続けます。まず、バイアルを37°Cに設定された水浴に30秒間浸すことにより、100,000個のCD34 + UCB細胞を解凍します。
1ミリリットルの解凍培地をバイアルに滴下し、ピペッティングで上下させて細胞を穏やかに再懸濁します。再懸濁した細胞懸濁液を一滴ずつ5ミリリットルの霜取り培地に移します。次に、細胞懸濁液を室温で320Gで8分間遠心分離します。
10ミリリットルの蛍光活性化セルソーティングまたはFACSバッファーで細胞をDNAseで洗浄します。細胞を再度遠心分離した後、ペレットを2ミリリットルの刺激媒体に再懸濁します。2ミリリットルの細胞懸濁液を24ウェルプレートに移し、プレートを摂氏37度で4〜6時間インキュベートします。
次に、蛍光活性化セルソーティングチューブに細胞を回収し、1ミリリットルの幹細胞培地を補充します。ウイルスを解凍した後、必要な量を刺激媒体に追加して、30回の感染の多様性を達成します。ペレット化した細胞をウイルス含有培地にウイルス含有培地に100,000細胞の密度で再懸濁し、それらを96ウェルプレートの1ウェルに移す。
空の井戸にPBSを加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、96ウェルプレートのウェルから全量の細胞懸濁液を、1ミリリットルの幹細胞培地を含むFACSチューブに移します。ウェルとピペットチップを幹細胞培地で洗浄し、2ミリリットルの幹細胞培地をFACSチューブに加えます。
FACSチューブを遠心分離した後、上清を捨て、細胞ペレットを2ミリリットルの増殖培地に再懸濁します。懸濁液を24ウェルプレートのウェルに移し、細胞をインキュベートします。まず、EGFPレポーターで形質導入したCD34+細胞の全量を別のFACSチューブに移します。
320 Gで室温で8分間遠心分離します。ペレット化した細胞を100マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。チューブあたり5マイクロリットルのCD34抗体を添加し、チューブを4°Cの暗所で20分間インキュベートします。
次に、DAPIを含む1ミリリットルのFACSバッファーに細胞を再懸濁し、室温で320Gで8分間遠心分離します。DAPIを含む200マイクロリットルのFACSバッファーに細胞を再懸濁した後、ソーティング前に40マイクロメートルのストレーナで細胞懸濁液をろ過します。次に、PBS100マイクロリットル中のビーズ1滴にCD34抗体0.5マイクロリットルを添加します。
混合物を暗所で摂氏4度で20分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのPBSを混合物に加えます。室温で320Gで8分間遠心分離します。
上清を捨て、ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次に、GFP陰性およびGFP陽性の白血病細胞をFACSチューブに加えます。細胞を1ミリリットルのFACS緩衝液で洗浄します。
細胞を遠心分離した後、100, 000個のGFP陰性細胞と100, 000個のGFP陽性細胞を、それぞれ500マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。ソーティング前に、40μmのストレーナで細胞懸濁液をろ過します。次に、選別した細胞を幹細胞培地に集めます。
細胞を室温で320Gで8分間遠心分離します。次に、細胞を3ミリリットルの赤血球分化培地に再懸濁します。次に、再懸濁した細胞の1ミリリットルを24ウェルプレートの3つのウェルに分注します。
すべての外側のウェルにPBSを充填します。培地をリフレッシュするには、細胞がプレートの底に落ち着いていることを確認してください。プレートをそっと傾け、500マイクロリットルのメディアを取り除きます。
次に、500マイクロリットルの2Xサイトカイン赤血球分化培地を添加して、プレートをリフレッシュします。6日目に、細胞を12ウェルプレートに移し、各ウェルに1ミリリットルの培地を加えて、最終容量が2ミリリットルになるようにします。12ウェルプレートの各ウェルから200マイクロリットルの細胞を採取します。
取り外した容量を250マイクロリットルの2X赤血球分化培地と交換します。.各収集チューブに1ミリリットルのFACSバッファーを追加します。チューブを遠心分離した後、ペレット化した細胞を100マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。
CD71、CD34、およびCD235a抗体をそれぞれ1マイクロリットルをチューブに加えます。次に、DAPIを含む1ミリリットルのFACSバッファーに細胞を再懸濁します。チューブを室温で320Gで8分間遠心分離します。
DAPIを使用して、細胞を200マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。DAPI対側散乱光またはSSCを設定して、デッドセルを除外します。SSC の高さと SSC の面積を設定して集計を除外し、1 つのセルを選択します。
前方散乱領域をSSCAに対して設定し、サイズに基づいて破片を除去します。CD235a と CD71 を設定します。CD34 と SSCA のセット。
GFP陽性細胞およびDAPI染色細胞をビーズで泳動します。読み取り値を補正し、補正をサイトメーターの設定に適用します。臍帯血由来のCD34陽性細胞は、アネキシンV陽性アポトーシス細胞が4日目の14.4%から17日目に34.2%に増加したことを示しました。
棒グラフは、17日目までにアネキシンV陽性細胞の割合が大幅に増加し、約40%に達したことを示しています
