Nos recherches portent sur la leucémie, plus précisément sur les syndromes myélodysplasiques ou la néoplasie myélodysplasique. Il s’agit d’une maladie des cellules souches provenant des cellules souches hématopoïétiques. Il affecte diverses lignées de cellules sanguines, en particulier la lignée érythroïde, qui est responsable de la production de cellules sanguines cardiaques.
La perturbation de cette lignée peut entraîner l’anémie, qui est fréquemment observée chez les patients atteints de SMD. Le pipeline que nous présentons dans cet article permet une méthode robuste et simplifiée pour évaluer l’efficacité de l’érythroblaste humain in vitro lors d’une modification génétique ou d’un traitement médicamenteux. Les cellules souches hématopoïétiques sont présentes de la naissance jusqu’au dernier moment de notre vie.
Il n’y a plus de tissu prolifératif dans notre organisme avec des milliards de cellules produites chaque jour. Il y a encore tellement de choses à comprendre, alors nous continuerons à étudier ces cellules étonnantes dans les tissus aminés sains, en mettant l’accent sur la protéostasie et la biologie de l’ARN. Pour commencer, décongelez 100 000 cellules CD34+UCB en plongeant le flacon pendant 30 secondes dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius.
Ajoutez un millilitre de milieu de décongélation goutte à goutte dans le flacon, puis remettez doucement les cellules en suspension en pipetant de haut en bas. Transférez la suspension de cellule en suspension goutte à goutte dans cinq millilitres de produit de décongélation. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire pendant huit minutes à 320 G à température ambiante.
Lavez les cellules dans 10 millilitres de tri cellulaire activé par fluorescence ou de tampon FACS avec DNAse. Après avoir centrifuger à nouveau les cellules, remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de stimulation. Transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits et incubez la plaque pendant quatre à six heures à 37 degrés Celsius.
Ensuite, collectez les cellules dans des tubes de tri cellulaire activés par fluorescence et remplissez-les d’un millilitre de milieu de cellules souches. Après la décongélation du virus, ajoutez le volume requis aux milieux de stimulation pour obtenir une multiplicité d’infection de 30. Remettez en suspension les cellules granulées dans un milieu contenant le virus à une densité de 100 000 cellules pour 100 microlitres de virus et transférez-les dans un puits d’une plaque de 96 puits.
Ajoutez du PBS dans les puits vides et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Transférez ensuite le volume complet de suspension cellulaire du puits de la plaque à 96 puits dans des tubes FACS avec un millilitre de milieu de cellules souches. Lavez le puits et l’embout de la pipette avec un milieu de cellules souches pour ajouter deux millilitres de milieu de cellules souches dans le tube FACS.
Après avoir centrifugé le tube FACS, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de milieu d’expansion. Transférez la suspension dans un puits d’une plaque de 24 puits et incubez les cellules. Pour commencer, transférez le volume complet des cellules CD34+ transduites avec le rapporteur EGFP dans un tube FACS séparé.
Centrifuger à 320 G pendant huit minutes à température ambiante. Remettre en suspension les cellules granulées dans 100 microlitres de tampon FACS. Ajoutez cinq microlitres d’anticorps CD34 par tube et incubez les tubes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon FACS contenant du DAPI et centrifugez pendant huit minutes à 320 G à température ambiante. Après avoir remis les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon FACS contenant du DAPI, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres avant le tri. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitre d’anticorps CD34 à une goutte de billes dans 100 microlitres de PBS.
Incuber le mélange dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajoutez ensuite un millilitre de PBS au mélange. Centrifuger pendant huit minutes à 320 G à température ambiante.
Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez des cellules leucémiques GFP négatives et GFP positives dans un tube FACS. Lavez les cellules dans un millilitre de tampon FACS.
Après avoir centrifugé les cellules, remettez en suspension 100 000 cellules GFP négatives et 100 000 cellules GFP positives, chacune dans 500 microlitres de tampon FACS. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres avant le tri. Ensuite, collectez les cellules triées dans un milieu de cellules souches.
Centrifugez les cellules pendant huit minutes à 320 G à température ambiante. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans trois millilitres de milieu de différenciation érythroïde. Maintenant, distribuez un millilitre des cellules remises en suspension dans trois puits d’une plaque de 24 puits.
Remplissez tous les puits extérieurs avec du PBS. Pour rafraîchir le support, assurez-vous que les cellules se sont déposées au bas de la plaque. Inclinez doucement la plaque et retirez 500 microlitres de support.
Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieux de différenciation des cytokines érythroïdes 2X pour rafraîchir la plaque. Le sixième jour, transférez les cellules dans une plaque à 12 puits et ajoutez un millilitre de média dans chaque puits pour atteindre un volume final de deux millilitres. Prélevez 200 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque à 12 puits.
Remplacer le volume retiré par 250 microlitres de milieu de différenciation érythroïde 2X. Ajoutez un millilitre de tampon FACS dans chaque tube de prélèvement. Après avoir centrifugé les tubes, remettre en suspension les cellules granulées dans 100 microlitres de tampon FACS.
Ajoutez un microlitre chacun d’anticorps CD71, CD34 et CD235a dans les tubes. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon FACS contenant du DAPI. Centrifugez les tubes pendant huit minutes à 320 G à température ambiante.
Remettre les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon FACS avec DAPI. Réglez DAPI par rapport à la diffusion latérale ou SSC pour exclure les cellules mortes. Définissez la hauteur SSC en fonction de la surface SSC pour exclure les agrégats et sélectionner des cellules uniques.
Définissez la zone de diffusion vers l’avant par rapport à SSCA pour éliminer les débris en fonction de la taille. Réglez CD235a par rapport à CD71. Réglez CD34 par rapport à SSCA.
Exécutez des billes de cellules positives à la GFP et des cellules colorées au DAPI. Compensez les lectures et appliquez la compensation aux paramètres du cytomètre. Les cellules CD34 positives du sang de cordon ombilical ont montré une augmentation des cellules apoptotiques positives à l’annexine V, passant de 14,4 % le quatrième jour à 34,2 % le 17e jour.
Le graphique à barres montre une augmentation significative du pourcentage de cellules positives à l’annexine V au 17e jour, atteignant environ 40 %
