この研究は、免疫応答で重要な役割を果たすヘルパーT細胞のサブセットであるTh17細胞の分化を研究するための標準的なプロトコルを提供します。Cas9トランスジェニックマウスの初代T細胞へのガイドRNAのレトロウイルス形質導入により、科学者はTh17分化の調節における遺伝子の特定の機能を研究することができます。この研究では、CRISPR-Cas9技術を用いて精密な遺伝子編集を行い、レトロウイルス形質導入を利用して初代T細胞の特定の遺伝子を効率的に標的としています。
フローサイトメトリーは、形質導入効率の評価と細胞分化のモニタリングに使用されます。In vitro Th17分極は、CT4+T細胞の分化を刺激するために行われます。私たちの研究は、特定の遺伝子がTh17の分化をどのように制御するかについての理解のギャップを埋めることを目的としています。
私たちはCRISPR-Cas9とレトロウイルス形質導入を使用しており、従来のノックアウトマウスモデルに代わる、より迅速で費用対効果の高い方法を提供しています。私たちのプロトコールは、CD4 T細胞のレトロウイルス形質導入を詳述するだけでなく、他のプロトコールでは見落とされがちなsgRNA配列のトレーニングとプラスミドの構築に関する包括的なガイドを提供します。この論文では、実験プロセスの各ステップを概説し、他の研究者が方法論を簡単に再現できるようにしています。
まず、CRISPickツールを使用して、RORガンマTノックアウト用のシングルガイドRNAを設計します。リファレンスゲノムをMouse GRCM 38とし、CRISPRkoガイドシステムに基づいてPAM配列をNGGと指定します。Quick Gene Lookup列の下の検索ボックスにターゲット遺伝子名を入力します。
システムが正しい遺伝子IDとターゲット遺伝子のフルネームを表示し、正確な選択が確実であることを確認してください。高い組み合わせランクとピック順に基づいて、RORC配列を標的とする単一のガイドRNAを1つ選択することで、オフターゲットマッチを最小限に抑え、オンターゲットの有効性を高めます。Mouse Gecko V2ライブラリからノンターゲティングシングルガイドRNA配列を選択します。
DNAポリメラーゼをPCRで使用して、シングルガイドRNAおよびベクター配列領域用に設計されたプライマーを用いて、シングルガイドRORCおよびシングルガイドノンターゲットコーディング配列を増幅します。増幅した配列をPMXU 6MCSベクターにクローニングし、U6プロモーターとmCherry蛍光タンパク質のフレーム内のガイドRNAスキャフォールドの間に配置します。次に、ベクター構築のためのPCRプログラムを設定します。
トランスフェクションの1日前に、10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEMを含む10cmの皿に、6つのPlat-E細胞のパワーで約8×10のシードを施します。細胞が80%の密度に達するまで、5%二酸化炭素の下で摂氏37度で細胞をインキュベートします。トランスフェクションの1時間前に、細胞培養培地を、フェノールレッドを含まない8ミリリットルの温かい還元血清培地(5%FBSを含むが、ペニシリンやストレプトマイシンを含まない)と交換します。
トランスフェクションMix 1を調製し、Mix 2を調製します。一滴ずつ、Mix 1にMix 2を加えて、優しく混ぜていきます。混合物を摂氏20〜25度で15〜20分間インキュベートします。
プレートを静かに渦巻かせながら、トランスフェクション混合物をPlat-E細胞に一滴ずつ加えます。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と6〜12時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を10ミリリットルの新鮮な細胞培養培地と交換し、5%二酸化炭素を含む摂氏37度で48時間インキュベートを続けます。
蛍光顕微鏡を使用してレトロウイルスベクタータグを検出することにより、Plat-E細胞のトランスフェクション効率を評価します。次に、ウイルス含有培養上清を1,500Gで10分間遠心分離し、細胞断片を除去する。ウイルス含有上清を1ミリリットルのバイアルに分注します。.
まず、24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、1ミリリットルあたり2マイクログラムの抗CD3イプシロンと1ミリリットルあたり4マイクログラムの抗CD28を500マイクロリットルのPBSにコーティングします。プレートをパラフィルムで包み、摂氏4度で一晩インキュベートします。マウス脾臓を採取した後、滅菌したすりガラスを使用してFACS緩衝液で粉砕し、組織を単一細胞懸濁液に均質化します。
細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーでろ過し、50ミリリットルのチューブに入れます。脾臓細胞懸濁液を800Gで5分間遠心し、ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。混合物を室温で5分間放置します。
次に、FACSバッファーを添加して、総容量15ミリリットルにします。遠心分離後、脾臓細胞をFACSバッファーに再懸濁し、40μメートルのセルストレーナーでろ過します。FACSバッファーで最終容量を1ミリリットルに調整し、市販の試薬キットを使用して、製造元の指示に従ってCD4+T細胞を単離します。
CD4+T細胞を蛍光抗体混合物で標識します。染色した細胞をFACSバッファーで洗浄した後、フローセルソーターを使用してナイーブCD4+T細胞を単離します。次に、プレート結合刺激上清を除去した後、24ウェルプレートの各ウェルを500マイクロリットルのPBSで2回すすぎます。
各ウェルのリンパ球培養培地1ミリリットルにナイーブCD4+T細胞6個の力で10回1回プレートし、18〜24時間インキュベートします。翌日、活性化した細胞を1.5ミリリットルのチューブに集め、800Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを1ミリリットルの感染混合物に再懸濁し、1ミリリットルの混合物を48ウェルプレートのウェルに加えます。
プレートをパラフィルムで包み、800Gで摂氏32度、加減速を3に設定して90分間遠心分離します。遠心分離後、パラフィルムを取り出し、細胞を4時間インキュベートします。抗原提示細胞(APC)を調製するには、15ミリリットルのチューブにマイトマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含むリンパ球培養培地1ミリリットルに脾細胞を再懸濁します。
脾細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と1時間インキュベートします。次に、15ミリリットルのマークにPBSを加え、800Gで5分間遠心分離します。脾臓細胞を1ミリリットルのリンパ球培養培地に再懸濁し、セルカウンターマシンで細胞数をカウントします。
レトロウイルス感染後、形質導入したCD4+T細胞を1.5ミリリットルのチューブで遠心分離し、感染した細胞を600マイクロリットルのPBSに再懸濁します。リンパ球培養培地1ミリリットルに、形質導入したCD4+T細胞6個分の0.5倍、APC細胞6個分の1.5倍を24ウェル培養プレートのウェルに入れます。1ミリリットルあたり2マイクログラムの抗CD3イプシロン、1ミリリットルあたり2マイクログラムの抗CD28、およびTh17分化カクテルを補給します。.
細胞を摂氏37度で2日間、5%の二酸化炭素で培養します。2日後、細胞懸濁液を1.5ミリリットルチューブで遠心分離し、TGFベータ1ミリリットルあたり3ナノグラムおよびインターロイキン61ミリリットルあたり30ナノグラムを含むリンパ球培養培地1ミリリットルにペレットを再懸濁します。細胞を24ウェルプレートのウェルに2日間移します。
分化した細胞を、PMA1ミリリットルあたり50ナノグラム、イオノマイシン1ミリリットルあたり500ナノグラム、およびブレフェルデンA1ミリリットルあたり5マイクログラムで、24ウェルプレートの新しいウェルで500マイクロリットルのリンパ球培養培地で処理します。細胞を摂氏37度で4時間インキュベートします。処理した細胞を、1ミリリットルのFACS緩衝液を含む1.5ミリリットルのチューブに集めます。
遠心分離後、蛍光抗体混合物を含むPBSで細胞を摂氏4度で30分間染色します。染色した細胞を300マイクロリットルのPBSで洗浄してから、300マイクロリットルの2%リン酸緩衝ホルムアルデヒドで摂氏4度で60分間固定します。細胞をPBSで洗浄した後、細胞を600マイクロリットルの透過化緩衝液に再懸濁し、800Gで5分間遠心分離します。
抗インターロイキン17A抗体を100μLの透過化緩衝液中で室温で60分間染色します。レトロウイルス感染効率は、mCherry陽性細胞によって示されるように、約40%であったTh17分化効率は、RORガンマT遺伝子を標的とする単一ガイドRNAで処理された細胞で有意に低下した。RORCおよびインターロイキン17Aの発現レベルは、シングルガイドRNA RORCで処理された細胞で大幅に減少しました。
