私たちは、極限耐容性クマムシHypsibius exemplarisの神経レジリエンスの分子メカニズムを明らかにすることに焦点を当てています。私たちは、極限環境にさらされた後の神経系の変化を研究しています。私たちは、クマムシが極限環境を経験した後、クマムシの神経解剖学的構造と運動機能に大規模な変化があることを発見しました。
クマムシを分子生物学研究のモデル生物として使用するのは比較的新しいことです。そのため、クマムシへの応用にはまだ完全に最適化されていない多くの技術があります。トランスクリプトミクス、プロテオミクス、トランスジェネシスの分野では目覚ましい進歩を遂げていますが、未開発の標的タンパク質の検証と機能評価に必要な方法とツールはまだあります。
単一のクマムシからのRNA抽出に関する現在のプロトコルは、まだqPCRに適用されておらず、抽出に複数の動物が必要です。クマムシの分子神経生物学の研究を続けるためには、個々の動物に由来するRNAを抽出して定量する方法が必要でした。まず、RNAシーケンシングの結果を確認し、次に、個別に注入した動物のRNAi効率を評価し、3つ目に、集団間の転写変化の個々のばらつきを調査する必要がありました。私たちの方法は、3つの点で以前の技術を改善しています。
これは、以前の単一のクマムシ抽出方法と比較して、抽出時間を約30%短縮します。また、この方法は、リニアPCR増幅ステップの必要性を回避するため、抽出コストを100倍以上削減します。最後に、私たちの方法は、RNAの大幅な損失につながることが多い精製の必要性を回避するため、以前の方法よりも200倍効率的です。
私たちの発見により、クマムシの研究者は、個々のクマムシのqRT-PCRを介して、低コストかつ効率的な方法で相対的な転写産物レベルを定量化することができます。これは、RNAiノックダウンの効率を高度に定量的に定量化し、シーケンシングヒットを確認し、さまざまな動物間での転写応答の個人差を調査するために使用されていることがわかります。まず、ブンゼンバーナーまたは別の制御された火炎源を低い設定で点灯させます。
ガラス製のマイクロピペットを片方の端を両手で持ち、ガラスが溶け始めるまでその中心を炎の上に置きます。柔らかくなったら、両端をすばやく引き離して、2つの鋭い先端を作成します。次に、滅菌済みの細い鉗子を使用して、マイクロピペットの先端を軽く折って切れ味を調整します。
ガラスマイクロピペットをマイクロピペットプーラーに固定し、加熱フィラメントとの接触を避けます。最適化の出発点として、182.2グラムのプルウェイトを使用して、1回のプルステップで極性を摂氏78度に設定します。フィラメントを加熱すると、ガラスマイクロピペットが重力により鋭利な先端を持つ2つのマイクロピペットに分離します。
引っ張ったガラスマイクロピペットを密閉した100mmのペトリ皿に保管し、鋭利な先端が壊れないようにワックスまたは粘土で固定します。まず、希望の寸法のプルガラス製マイクロピペットを入手します。次に、相補的DNA合成マスターミックスとクマムシ溶解バッファーを調製します。
クマムシ1本あたり2マイクロリットルの抽出に十分な溶解バッファーを分注してください。リボヌクレアーゼ阻害剤を溶解バッファーに添加して、マイクロリットルあたり4単位の最終濃度を達成します。溶液を短時間ボルテックスし、その後、卓上遠心分離機で2000gの室温で5秒間スピンダウンします。
溶液を氷上に保存します。滅菌フィルターチップ付きP1000ピペットを使用して、必要な数のクマムシを培養物から取り出し、滅菌済みの35mmシャーレに入れます。クマムシを1ミリリットルのオートクレーブ滅菌湧き水で3回洗浄し、藻類の汚染物質を取り除きます。
ディッシュを25倍から50倍の倍率で解剖顕微鏡の下に置き、フィルターチップ付きのP10ピペットを使用して、単一のクマムシを新しい滅菌35ミリメートルシャーレに移します。次に、滅菌フィルターチップ付きのP200ピペットを使用して、100マイクロリットルの滅菌ヌクレアーゼフリー水で単一のクマムシを洗浄します。洗浄したクマムシを、1〜2マイクロリットルの滅菌ヌクレアーゼフリー水中の清潔な滅菌PCRチューブに移します。
クマムシを解剖顕微鏡で25倍の倍率で視覚化します。水分の除去を容易にするために、引っ張ったガラスマイクロピペットの先端をチューブの外側で軽く折ってください。ガラス製マイクロピペットの毛細管現象を使用して、クマムシが小さな水の泡に囲まれるまで水分を取り除きます。
2マイクロリットルのクマムシ溶解バッファーをチューブに加えます。ボルテックス後、チューブを室温で2000gで5秒間短時間遠心分離し、サンプルを氷上に保存します。次に、クマムシを含むサンプルをPCRチューブラックに入れ、しっかりと固定します。
長くて粗い鉗子でラックをつかみ、サンプルが完全に凍結するまで液体窒素に静かに浸します。次に、液体窒素からラックを取り出し、氷の上に置きます。サンプルを解凍し、目に見える形で透明になるまで15秒ごとに監視します。
凍結融解プロセスを5回繰り返した後、サンプルを氷の上に置きます。2マイクロリットルの相補的DNA合成マスターミックスを、クマムシ溶解物を含むPCRチューブに加えます。チューブを短時間フリックし、室温で2000gで5秒間回転させ、サンプルを氷の上に置きます。
次に、サンプルをサーモサイクラーにロードし、cDNA合成プログラムを開始します。合成が完了したら、すぐにチューブを氷の上に置きます。サンプルを総容量25マイクロリットルに希釈し、21マイクロリットルの滅菌ヌクレアーゼフリー水で希釈します。
最適化されたプロトコルは、凍結融解サイクルを使用しないプロトコルと比較して、相補的DNA収量の3倍の増加を達成しました。これは6サイクルが最適です。残留水が存在すると RNA 抽出は成功せず、一貫した溶解のためには余分な水分を除去することが非常に重要であることが示されました。RNA収量は、クマムシ1匹あたり約14.24ナノグラムでした。
このプロトコルは、アクチン転写産物の収量において、RNA抽出キットよりも200倍以上効率的であり、Ct値が大幅に低く、ゲルバンド増幅が堅牢であることが実証されています。
