Ci stiamo concentrando sulla scoperta dei meccanismi molecolari della neuroresilienza nel tardigrado estremotollerante Hypsibius exemplaris. Studiamo i cambiamenti del sistema nervoso dopo l'esposizione ad ambienti estremi. Abbiamo scoperto cambiamenti su larga scala nelle strutture neuroanatomiche e nella funzione motoria nei tardigradi dopo che hanno sperimentato ambienti estremi.
L'uso dei tardigradi come organismo modello per la ricerca biologica molecolare è relativamente nuovo. Pertanto, ci sono molte tecniche che non sono ancora completamente ottimizzate per la loro applicazione nei tardigradi. Sebbene abbiamo fatto notevoli passi avanti nella trascrittomica, nella proteomica e nella transgenesi, ci sono ancora metodi e strumenti necessari per la verifica e la valutazione funzionale delle proteine bersaglio che rimangono sottosviluppate.
Gli attuali protocolli per l'estrazione di RNA da singoli tardigradi non sono ancora stati applicati alla qPCR o richiedono più animali per le estrazioni. Per continuare il nostro lavoro sulla neurobiologia molecolare del tardigrado, avevamo bisogno di un modo per estrarre e quantificare l'RNA derivato da singoli animali per confermare i risultati del sequenziamento dell'RNA, in secondo luogo, valutare l'efficienza dell'RNAi negli animali iniettati individualmente e, in terzo luogo, esplorare le variazioni individuali nei cambiamenti trascrizionali tra le popolazioni. Il nostro metodo migliora le tecniche precedenti in tre modi.
Riduce il tempo di estrazione di circa il 30% rispetto ai precedenti metodi di estrazione con singolo tardigrado. Il nostro metodo riduce anche il costo delle estrazioni di oltre 100 volte, in quanto evita la necessità di una fase di amplificazione PCR lineare. Infine, il nostro metodo è 200 volte più efficiente dei metodi precedenti in quanto aggira la necessità di una purificazione, che spesso si traduce in una significativa perdita di RNA.
I nostri risultati consentiranno ai ricercatori di quantificare i livelli di trascrizione relativi tramite qRT-PCR da singoli tardigradi in modo efficiente e a basso costo. Vediamo che questo viene utilizzato per quantificare l'efficienza del knockdown dell'RNAi in modo altamente quantitativo, confermare i colpi di sequenziamento ed esplorare le differenze individuali nella risposta trascrizionale tra vari animali. Per iniziare, accendi un bruciatore Bunsen o un'altra fonte di fiamma controllata a un'impostazione bassa.
Tenere una micropipetta di vetro con un'estremità in ciascuna mano e posizionarne il centro sulla fiamma fino a quando il vetro inizia a sciogliersi. Una volta ammorbidite, separare rapidamente le due estremità per creare due punte affilate. Quindi, utilizzando un paio di pinze sterili a punta, rompere leggermente la punta della micropipetta per regolarne l'affilatura.
Fissare una micropipetta di vetro su un estrattore per micropipette, evitando il contatto con il filamento riscaldante. Come punto di partenza per l'ottimizzazione, impostare la polare a 78 gradi Celsius con un singolo passo di trazione utilizzando un peso di trazione di 182,2 grammi. Lasciare riscaldare il filamento, facendo sì che la micropipetta di vetro si separi in due micropipette con punte acuminate a causa della gravità.
Conservare le micropipette di vetro estratte in una capsula di Petri chiusa da 100 millimetri e fissarle con cera o argilla per evitare che le punte affilate si rompano. Per iniziare, procurarsi le micropipette di vetro tirate delle dimensioni desiderate. Quindi preparare il Master Mix di sintesi complementare del DNA e il tampone di lisi tardigrada.
Aliquotare un tampone di lisi sufficiente per le estrazioni utilizzando due microlitri per tardigrado. Aggiungere l'inibitore della ribonucleasi al tampone di lisi per ottenere una concentrazione finale di quattro unità per microlitro. Agitare brevemente la soluzione, quindi farla girare in una centrifuga da tavolo a 2000 g per cinque secondi a temperatura ambiente.
Conservare la soluzione in ghiaccio. Utilizzando una pipetta P1000 con filtro sterile, rimuovere il numero richiesto di tardigradi dalla coltura e metterli in una capsula di Petri sterile da 35 millimetri. Lavare i tardigradi tre volte con un millilitro di acqua di sorgente sterile autoclavata per rimuovere i contaminanti algali.
Posizionare la piastra sotto un microscopio da dissezione con ingrandimento da 25X a 50X e utilizzare una pipetta P10 con punta filtrante per trasferire un singolo tardigrado in una nuova piastra di Petri sterile da 35 millimetri. Ora, con una pipetta P200 con filtro sterile, lavare il singolo tardigrado in 100 microlitri di acqua sterile priva di nucleasi. Trasferire il tardigrado lavato in una provetta PCR sterile pulita in uno o due microlitri di acqua sterile priva di nucleasi.
Visualizza il tardigrado con un microscopio da dissezione a un ingrandimento 25X. Per facilitare la rimozione dell'acqua, rompere leggermente la punta della micropipetta di vetro estratta all'esterno del tubo. Utilizzando l'azione capillare della micropipetta di vetro, rimuovere l'acqua fino a quando il tardigrado non è circondato da una piccola bolla d'acqua.
Aggiungere due microlitri di tampone di lisi tardigrada alla provetta. Dopo il vortex, centrifugare brevemente la provetta a temperatura ambiente per cinque secondi a 2000 g e conservare il campione in ghiaccio. Quindi posizionare il campione contenente tardigradi in un rack per provette PCR e fissarlo saldamente.
Afferrando il rack con una pinza lunga e grossolana, immergerlo delicatamente nell'azoto liquido fino a quando il campione non è completamente congelato. Quindi, rimuovere la griglia dall'azoto liquido e metterla sul ghiaccio. Scongelare il campione, monitorandolo ogni 15 secondi fino a quando non diventa visibilmente trasparente.
Dopo aver ripetuto il processo di congelamento-scongelamento cinque volte, posizionare il campione sul ghiaccio. Aggiungere due microlitri di sintesi complementare di DNA Master Mix alla provetta PCR contenente lisato tardigrado. Azionare brevemente la provetta e farla girare a 2000 g per cinque secondi a temperatura ambiente e posizionare il campione sul ghiaccio.
Ora, caricare il campione in un termociclatore e avviare il programma di sintesi del cDNA. Al termine della sintesi, posizionare immediatamente la provetta sul ghiaccio. Diluire il campione fino a un volume totale di 25 microlitri con 21 microlitri di acqua sterile priva di nucleasi.
Il protocollo ottimizzato ha ottenuto un aumento di tre volte della resa di DNA complementare rispetto ai protocolli senza cicli di congelamento-scongelamento, con sei cicli ottimali. L'estrazione dell'RNA non ha avuto successo in presenza di acqua residua, dimostrando la necessità critica di rimuovere l'acqua in eccesso per una lisi costante. La resa dell'RNA era di circa 14,24 nanogrammi per tardigrado.
Questo protocollo è risultato oltre 200 volte più efficiente dei kit di estrazione dell'RNA nella resa del trascritto di actina, come dimostrato da valori di Ct significativamente più bassi e da una robusta amplificazione della banda di gel.
