私たちの研究室では、サイクリックAMPの空間的および時間的な制御を調査し、どのような条件が特定のダウンストリームイベントを引き起こすかを理解しています。サイクリックAMPシグナル伝達の細胞内活性化と阻害を効果的に模倣するために、bPAC-ナノルシフェラーゼと呼ばれる光遺伝学的ツールの分布を特徴付けます。現在のサイクリックAMPシグナル伝達モデルの有効性を検証するために、私たちは生細胞の細胞内コンパートメントからのサイクリックAMPシグナル伝達を評価、模倣、およびブロックするツールを開発しました。
このプロトコルは、光遺伝学的ツールの分布と機能を体系的に刺激し、評価するために使用できます。私たちの目標は、フォーカスライトプロセスが特定の細胞ゾーンで光遺伝学的タンパク質を正確に活性化し、周囲のタンパク質への影響を回避できるかどうかをテストすることでした。この方法は、拡散分布を持つタンパク質の研究や、サイクリックAMPやその他のシグナル伝達分子の局所的な増加を意図した効果が引き起こすことである場合に不可欠です。
光遺伝学的実験では、典型的なアプローチとして、細胞の全領域または場合によってはより小さな指定された領域を刺激する。ただし、この領域と強度の選択は、多くの場合、任意です。当社の体系的なアプローチにより、研究者はより正確な実験を行うことができ、シグナル伝達経路のパターンを模倣するのに役立ちます。
この研究では、核標的サイクリックAMPセンサーと光遺伝学的核標的タンパク質であるNLS-bPAC-ナノルシフェラーゼを同時トランスフェクションした細胞を使用します。暗い環境で核bPACを発現する細胞を培養および操作します。赤色のセーフライトランプを使用して、500ナノメートル未満の波長への曝露を避けてください。
マルチLEDライトエンジン、発光フィルターホイール、電動XYステージ、ORCA-Fusion Digital CMOSカメラ、開口数1.4の倍率100倍オイル対物レンズを装備した電動2デッキ顕微鏡でイメージング実験を行います。画像をキャプチャするには、デジタル顕微鏡ソフトウェアを使用します。このセットアップは、ZT458rdcダイクロイックフィルターを装備した独立した光路を使用して、細胞の刺激とFRET測定を同時に行うことができます。
UGA-42 GeosystemとLDI-7レーザーをオンにした後、顕微鏡の電源を入れて、H208 FRETセンサーでデータを取得するために適切にセットアップします。次に、イメージングソフトウェアと顕微鏡を制御するSysConソフトウェアを順番に開きます。毎回使用する前にシステムをキャリブレーションするには、カメラウィンドウに移動し、[キャリブレーション]タブを選択します。
光遺伝学的タンパク質と適合するレーザー波長を設定します。bPAC-ナノルシフェラーゼを刺激するために445ナノメートルを選択します。[カメラ]タブを選択し、[取得の開始]をクリックして、イメージングソフトウェアからの取得を開始します。
[キャリブレーション] タブをもう一度選択します。「キャリブレーションの開始」ボタンをクリックします。表示されるドロップダウンリストで、適切なキャリブレーションモードを選択します。
メーカーが指示するキャリブレーション手順に従います。必要に応じて、イメージングソフトウェアの設定を変更して、適切なキャリブレーションを実行します。キャリブレーションは、サンプルの無細胞領域で行ってください。
次に、イメージングソフトウェアを使用して、1つの蛍光画像を取得します。蛍光セルがImage Viewerウィンドウに表示されます。顕微鏡制御XYを使用して刺激される細胞を影響領域内、できればその中心に配置します。
実際の実験を開始する前に、Click-And-Fire Modeを使用して、個々の細胞の応答性を迅速に評価してください。「タイムライン」ウインドウで、光源、持続時間、刺激の強度など、細胞刺激パラメータを調整します。[Image Viewer] ウィンドウで、セルのほぼ中央をクリックし、応答を評価します。
Image Viewerウィンドウで、左側のツールバーにある丸いアイコンを選択し、ドロップダウンメニューでFilledをクリックして、塗りつぶされた円形の刺激オブジェクトを描画します。この手順を繰り返して、複数の同一の円を作成し、それらを均等に分布させることで、刺激する細胞の細胞質全体を均一にカバーします。「Image Viewer」ウィンドウで、左側にあるマウス・ポインター・アイコンをクリックし、スティミュレーション・オブジェクトの1つを右クリックして、そのプロパティを確認および編集します。
または、描画されたすべての刺激オブジェクトを選択し、右クリックして、選択したすべての刺激オブジェクトのプロパティをまとめて編集します。[表示] サブウィンドウで、[グリッドにスナップ] ボタンをクリックします。このグリッドは、円の間隔と配置を均等に維持して、適切な行列または配列を形成するのに役立ちます。
さらに、[グリッドの設定] ボタンを使用してグリッドのプロパティをカスタマイズします。グリッドの助けを借りて、刺激オブジェクトを均等に分散します。必要に応じて、細胞全体を覆うように刺激オブジェクトを追加します。
すべてのプロパティが同じであることを確認します。Image Viewerウィンドウで以前に作成した各スティミュレーションオブジェクトは、Timelineウィンドウに表示され、開始時間、持続時間、遅延、強度など、さまざまなプロパティセットを編集できます。スティミュレーションオブジェクトを適切に視覚化するには、まずタイムラインウィンドウを展開します。
これで、Timelineウィンドウで刺激オブジェクトの時間的プロパティを確認できます。すべてのスティミュレーションオブジェクトを選択し、Object Timingサブウィンドウでそれらの遅延と持続時間を編集します。[光源] サブウィンドウで、オブジェクトの波長と強度を設定します。
すべての波長と強度を同一にします。2つ以上の刺激の影響が重ねられるのを防ぐには、各オブジェクトに異なる開始時間を設定するか、予想される結果に応じてオブジェクト間の遅延を変化させます。次に、タイムラインウィンドウで、必要に応じて各刺激オブジェクトがアクティブ化されるシーケンスを変更します。
実験に応じて、刺激のシーケンスを規則的またはランダムなパターンで構成します。シーケンスをシステムにアップロードした後、シーケンスサブウィンドウでシステムが実行するシーケンスサイクルまたは実行の数を設定します。刺激された細胞の蛍光変化を測定するには、イメージングソフトウェアの関心領域を目的の位置に配置します。
蛍光画像の取得を開始します。最後に、UGA-42ウィンドウでPlayを押して、細胞の刺激を開始します。カメラでもキャプチャできる実際の刺激ビームと、刺激オブジェクトとの相関関係を観察します。
緑色のトレースの強度の変化のみに注目してください。これは、センサーによって測定されたサイクリックAMP濃度の増加を示しています。これは、ビームが最小量のbPAC-ナノルシフェラーゼで細胞の一部に到達したときに特に発生します。H208のYFP蛍光を使用して、原子核の位置を決定しました。
核全体をカバーする関心領域を使用して、示された青色のスポットでの刺激によるH208センサーのFRET比の変化を測定しました。これにより、サイクリックAMPの一時的な増加は、bPAC-ナノルシフェラーゼを含む領域に青色光が向けられた場合にのみ発生することが明らかになりました。これにより、核を標的とするbPAC-ナノルシフェラーゼがHC-1細胞の核コンパートメントでのみ発現していることが確認されました。
