Il nostro laboratorio studia la regolazione spaziale e temporale dell'AMP ciclico per capire quali condizioni innescano specifici eventi a valle. Per imitare efficacemente l'attivazione subcellulare e l'inibizione della segnalazione ciclica dell'AMP, caratterizziamo la distribuzione di uno strumento optogenetico chiamato bPAC-nanoluciferasi. Per testare la validità degli attuali modelli di segnalazione AMP ciclica, abbiamo sviluppato strumenti per valutare, imitare e bloccare la segnalazione AMP ciclica dai compartimenti subcellulari nelle cellule viventi.
Questo protocollo può essere utilizzato per stimolare e valutare la distribuzione e la funzione di strumenti optogenetici in modo sistematico. Beh, il nostro obiettivo era quello di verificare se il processo di focalizzazione della luce può attivare con precisione le proteine optogenetiche in specifiche zone cellulari, evitando così l'impatto sulle proteine circostanti. Questo metodo sarà vitale per lo studio delle proteine con distribuzioni diffuse o se l'effetto desiderato è quello di generare aumenti localizzati dell'AMP ciclico o di altre molecole di segnalazione.
Negli esperimenti optogenetici, l'approccio tipico prevede la stimolazione di un intero campo di cellule o talvolta di aree designate più piccole. Tuttavia, la selezione di quest'area e intensità è spesso arbitraria. Il nostro approccio sistematico consente ai ricercatori di condurre esperimenti più accurati, aiutando a imitare i modelli delle vie di segnalazione.
Per questo studio, utilizzare cellule co-trasfettate con un sensore AMP ciclico a bersaglio nucleare e una proteina optogenetica a bersaglio nucleare, NLS-bPAC-nanoluciferasi. Coltivare e manipolare le cellule che esprimono il bPAC nucleare in un ambiente buio. Utilizzare una lampada a luce di sicurezza rossa per evitare l'esposizione a lunghezze d'onda inferiori a 500 nanometri.
Esegui gli esperimenti di imaging in un microscopio motorizzato a due piani dotato di un motore di luce multi-LED, una ruota portafiltri di emissione, uno stadio XY motorizzato, una fotocamera CMOS digitale ORCA-Fusion e un obiettivo a olio con ingrandimento 100x con apertura numerica di 1,4. Per acquisire le immagini, utilizzare un software di microscopia digitale. Questa configurazione è in grado di stimolare le cellule ed eseguire simultaneamente misure FRET utilizzando un percorso luminoso indipendente dotato di un filtro dicroico ZT458rdc.
Dopo aver acceso l'UGA-42 Geosystem e i laser LDI-7, accendere il microscopio per impostarlo in modo appropriato per l'acquisizione dei dati con il sensore FRET H208. Quindi, aprire in sequenza il software di imaging e il software SysCon che controlla il microscopio. Per calibrare il sistema prima di ogni utilizzo, accedere alla finestra Fotocamera e selezionare la scheda Calibrazione.
Impostare la lunghezza d'onda del laser compatibile con la proteina optogenetica. Scegli 445 nanometri per stimolare la bPAC-nanoluciferasi. Selezionare la scheda Fotocamera e fare clic su Avvia acquisizione per avviare l'acquisizione dal software di imaging.
Selezionare nuovamente la scheda Calibrazione. Fare clic sul pulsante Avvia calibrazione. Nell'elenco a discesa visualizzato, selezionare la modalità di calibrazione corretta.
Seguire i passaggi di calibrazione indicati dal produttore. Se necessario, modificare le impostazioni del software di imaging per eseguire la calibrazione corretta. Assicurarsi di eseguire la calibrazione su un'area priva di celle del campione.
Successivamente, utilizzando il software di imaging, acquisire un'immagine a fluorescenza. Le celle fluorescenti appariranno nella finestra del Visualizzatore immagini. Posizionare la cellula che verrà stimolata utilizzando i controlli del microscopio XY all'interno dell'area di influenza, preferibilmente al suo centro.
Prima di iniziare l'esperimento vero e proprio, utilizzare la modalità Click-And-Fire per valutare rapidamente la reattività di una singola cellula. Nella finestra Timeline, regolare i parametri di stimolazione cellulare, tra cui la sorgente luminosa, la durata e l'intensità dello stimolo. Nella finestra Visualizzatore immagini, fare clic approssimativamente al centro della cella e valutare la risposta.
Nella finestra del visualizzatore di immagini, seleziona l'icona rotonda nella barra degli strumenti a sinistra e, nel menu a discesa, fai clic su Riempito per disegnare oggetti di stimolazione circolare pieni. Ripetere questo passaggio per creare più cerchi identici e distribuirli uniformemente, garantendo una copertura omogenea dell'intero citoplasma della cellula da stimolare. Nella finestra Visualizzatore immagini, fare clic sull'icona del puntatore del mouse a sinistra, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse su uno degli oggetti di stimolazione per verificarne e modificarne le proprietà.
In alternativa, selezionare tutti gli oggetti di stimolazione disegnati, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per modificare le proprietà di tutti gli oggetti di stimolazione selezionati. Nella sottofinestra Visualizza, fare clic sul pulsante Aggancia alla griglia. Questa griglia può aiutare a mantenere una spaziatura e un allineamento uniformi dei cerchi per formare una matrice o una matrice adeguata.
Inoltre, è possibile personalizzare le proprietà della griglia con il pulsante Imposta griglia. Distribuire uniformemente gli oggetti di stimolazione con l'aiuto della griglia. Se necessario, aggiungere altri oggetti di stimolazione per coprire l'intera cellula.
Assicurarsi che tutte abbiano le stesse proprietà. Ogni oggetto di stimolazione precedentemente creato nella finestra Visualizzatore immagini sarà presente nella finestra Timeline, dove è possibile modificare un diverso insieme di proprietà, tra cui l'ora di inizio, la durata, il ritardo, l'intensità e altro ancora. Per visualizzare correttamente gli oggetti di stimolazione, espandere prima la finestra Timeline.
Ora, si possono vedere le proprietà temporali degli oggetti di stimolazione nella finestra Timeline. Seleziona tutti gli oggetti di stimolazione e modifica il loro ritardo e la loro durata nella sottofinestra Temporizzazione Oggetto. Nella sottofinestra Lightsource, configurare le lunghezze d'onda e le intensità dell'oggetto.
Garantisci lunghezza d'onda e intensità identiche per tutti. Per evitare di sovrapporre l'effetto di due o più stimolazioni, impostare orari di avvio diversi per ogni oggetto o variare il ritardo tra di loro a seconda del risultato atteso. Successivamente, nella finestra Timeline, modificare la sequenza in cui ciascun oggetto di stimolazione verrà attivato, se necessario.
Configura la sequenza di stimolazioni in uno schema regolare o casuale a seconda dell'esperimento. Dopo aver caricato la sequenza nel sistema, configurare il numero di cicli di sequenza o di esecuzioni che il sistema eseguirà nella sottofinestra Sequenza. Per misurare le variazioni di fluorescenza della cellula stimolata, posizionare le regioni di interesse nel software di imaging nelle posizioni desiderate.
Inizia ad acquisire immagini a fluorescenza. Infine, premi Riproduci nella finestra UGA-42 per iniziare a stimolare le cellule. Osservare i fasci di stimolazione effettivi che possono essere catturati anche dalla fotocamera e la loro correlazione con gli oggetti di stimolazione.
Notare la variazione di intensità della sola traccia verde, che mostra l'aumento della concentrazione di AMP ciclico misurata dal sensore. Ciò si verifica in particolare quando il raggio raggiunge una parte della cellula con la quantità minima di bPAC-nanoluciferasi. La fluorescenza YFP di H208 è stata utilizzata per determinare la posizione del nucleo.
Una regione di interesse che copre l'intero nucleo è stata utilizzata per misurare le variazioni del rapporto FRET del sensore H208 dovute alla stimolazione nei punti blu indicati. Ciò ha rivelato che gli aumenti transitori dell'AMP ciclico si sono verificati solo quando la luce blu è stata diretta verso aree contenenti la bPAC-nanoluciferasi. Ciò ha confermato che la bPAC-nanoluciferasi a bersaglio nucleare era espressa esclusivamente nel compartimento nucleare delle cellule HC-1.
