このプロトコルは、粗サンプル中のトポイソメラーゼ1活性を迅速かつ簡単な方法で検出するためのローリングサークル増幅法を示しています。この方法の主な利点は、経験の浅い研究者でも追跡が容易であり、粗抽出物を使用する場合、他のゲルベースのアッセイと比較して感度が高いことです。このプロトコルの適用は、薬物治療に対する反応の測定から、潜在的な抗癌または抗感染症効果を有する低分子化合物のスクリーニングにまで及ぶ。
手順を実演するのは、私たちの研究室のカロル・ミジェリンスキー開発スペシャリストです。まず、カスタム設計のシリコーンアイソレーターグリッドを機能化されたスライドに取り付けて、ウェルメーカーを作成します。ガラスの表面とシリコーンの間に気泡が形成されないように、シリコングリッドを押し下げます。
次に、5マイクロモル、5プライムアミノプライマーを1回の印刷バッファーに添加してプライマーミックスを調製する。次に、この混合物を4マイクロリットル各ウェルに加え、ウェルメーカーを飽和塩化ナトリウムを含むハイブリダイゼーションチャンバー内でインキュベートします。閉じた環状基質を生成するには、2マイクロリットルの5マイクロモルトポイソメラーゼ1特異的基質と2マイクロリットルの組換えトポイソメラーゼ1酵素または調製した細胞抽出物を16マイクロリットルのワンタイムトポイソメラーゼ反応バッファーに加えます。
この円の混合物を摂氏37度で30分間インキュベートし、2マイクロリットルの1%sdsを加えて酵素反応を停止します。ウェルメーカーを、摂氏50度に予熱したバッファー1で満たされたトレイに浸します。バッファーをウェルにピペットで入れて、ウェルメーカー内に気泡が残っていないことを確認してから、トレイを摂氏50度で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、緩衝液1を取り出し、洗浄の合間に1分間激しく振とうしながら蒸留水で2回洗浄する。水を取り除き、次に、摂氏50度に予熱したバッファー2をトレイに追加し、バッファー1で前に示したようにウェルメーカーをインキュベートして洗浄します。次に、ウェルメーカーを70%エタノールで1分間激しく振とうし、圧縮空気を使用してセットアップを乾燥させます。
ハイブリダイゼーションを行うには、調製した円混合物を4マイクロリットルの対応する各ウェルに加え、ウェルメーカーを37°Cの蒸留水を入れた湿度チャンバーに1時間入れます。インキュベーションの最後に、ウェルメーカーをそれぞれ1分間洗浄し、バッファー3、バッファー4、および70%エタノールを風乾させます。4マイクロリットルのRCA混合物を調製してウェルメーカーの各ウェルに加え、湿度チャンバー内で摂氏37度で2時間インキュベートします。
増幅された蛍光ローリングサークル生成物を顕微鏡で視覚化するには、まず、スライドをバッファー3、バッファー4、および70%エタノールで洗浄します。スライドを圧縮空気で乾燥させ、顕微鏡スライドに接着します。ウェルの位置をマーカーでマークしてから、ピンセットを使用してシリコングリッドを取り外します。
カメラで視覚化できるようにするには、dapiなしで2マイクロリットルの封入剤でスライドをマウントし、カバーガラスを追加します。60倍油浸対物レンズとカメラを備えた蛍光顕微鏡を使用してスライドを分析します。イメージング後、画像を画像Jにインポートし、[画像]、[スタック]、および[スタックする画像]をクリックして画像をスタックし、画像タイプを8ビットに変更します。
しきい値を設定するには、[画像]、[調整]、[しきい値]の順にクリックします。下のバーを255に設定し、右側の信号のみが赤で背景が黒になるように上のバーを調整します。しきい値を調整する前に、個々の画像をスイープし、画像に対応していることを確認してください。
実際の信号が消え始める前に、しきい値ができるだけ低く設定されていることを確認してください。信号をカウントするには、[解析]、[パーティクルの分析]の順にクリックし、画像J設定の要約フィールドがオンになっていることを確認します。4マイクロリットルの希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ビオチン抗体を各ウェルに加え、湿度チャンバー内で15〜25°Cで50分間インキュベートします。
インキュベーションの終わりに、ウェルメーカーをバッファー5でそれぞれ3分間3回洗浄し、乾燥させます。化学発光を可視化するには、新たに調製したECLルミノールと過酸化水素の混合物2マイクロリットルをウェルに加え、CCDカメラまたはX線フィルムを使用してスライドを視覚化します。あるいは、TMBで視覚化するには、バッファー5洗浄後にシリコングリッドを取り外し、スライド全体の上に400マイクロリットルのTMBを追加します。
スライドを湿度チャンバーに保管し、発色するまで5〜10分待ちます。発色後、スライドを70%tethanolで洗浄し、カメラや携帯電話でスライドを撮影し、画像Jソフトで解析します。画像を画像Jにインポートし、[画像タイプ]、[8ビット]の順にクリックして、画像タイプを8ビットに変更します。
ツールバーの長方形描画ツールを使用してバンドを個別に測定し、目的の領域を描画することにより、測定領域を制限します。クリックして強度を測定し、[分析]、[測定]の順にクリックします。次に、最初に描画した領域を次のバンドに移動してメジャーします。
すべてのバンドの強度を測定した後、目的のソフトウェアでデータをプロットします。定量から明らかなように、蛍光スキャナー読み出しによって決定されたトポイソメラーゼ1活性がここに描かれています。この読み出しは12.5ナノグラムの検出限界を有し、蛍光顕微鏡読み出しを用いて得られた代表的な画像および得られた定量をここに示す。
この読み出し法は、検出限界が0.1ナノグラムであり、増強化学発光法およびカラーオメトリック読み出し法の検出閾値は6ナノグラムであった。同じ読み出しを使用して、検出限界はECLで1, 250セル、TMBで312セルでした。トポイソメラーゼ1活性は大腸腺癌由来細胞の抽出物から測定した。
薬物スクリーニング適用の一例として、カンプトテシンまたはジメチルスルホキシドの存在下でトポイソメラーゼ1活性を測定した。定量結果は、カンプトテシンが予想通り基質のトポイソメラーゼ1一媒介環状化を阻害することを示した。これは、洗浄ステップと反応インキュベーション時間に特に注意を払うだけでよい単純なプロトコルです。
また、薬物がトポイソメラーゼ1活性をどのように阻害するかを調べることも可能であり、リードは高感度で実行が容易であり、潜在的なトポイソメラーゼ1阻害剤の迅速なスクリーニングを可能にし、トポイソメラーゼ1活性を癌における薬物応答のバイオマーカーとして使用する。
