يوضح هذا البروتوكول طريقة تضخيم الدائرة المتدحرجة للكشف عن نشاط توبويزوميراز 1 في العينات الخام بطريقة سريعة وبسيطة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في سهولة متابعتها أيضا من قبل باحثين غير متمرسين ، وهي أكثر حساسية مقارنة بالمقايسات الأخرى القائمة على الهلام عند استخدام المستخلصات الخام. يمتد تطبيق هذا البروتوكول من قياس الاستجابة للعلاج الدوائي ، إلى فحص مركبات الجزيئات الصغيرة ذات التأثير المحتمل المضاد للسرطان أو الأمراض المعدية.
سيتم توضيح الإجراء من قبل أخصائي تطوير Karol Mizielinski من مختبرنا. للبدء ، قم بتوصيل شبكة عازلة سيليكون مصممة خصيصا بشريحة وظيفية ، مما يجعل صانع البئر. اضغط لأسفل على شبكة السيليكون لتجنب تكوين فقاعات الهواء بين سطح الزجاج والسيليكون.
بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج التمهيدي عن طريق إضافة خمسة ميكرومولار ، وخمسة برايمر أميني رئيسي في مخزن مؤقت للطباعة مرة واحدة. ثم أضف أربعة ميكرولتر من هذا الخليط إلى كل بئر واحتضان صانع البئر في غرفة تهجين مع كلوريد الصوديوم المشبع. لتوليد ركائز دائرية مغلقة ، أضف ميكرولترين من خمسة ميكرومولار توبويزوميراز 1 ركيزة محددة واثنين ميكرولتر من إنزيم توبويزوميراز 1 المؤتلف أو مستخلص خلية محضر إلى 16 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل توبويزوميراز لمرة واحدة.
احتضن هذا الخليط الدائري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وأوقف تفاعل الإنزيم بإضافة ميكرولتر من 1٪ sds. اغمر صانع البئر في صينية مملوءة بالمخزن المؤقت 1 ، مسخن مسبقا عند 50 درجة مئوية. ماصة المخزن المؤقت في الآبار لضمان عدم بقاء فقاعات هواء داخل صانع البئر ، ثم احتضان الدرج لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت 1 واغسله مرتين بالماء المقطر مع اهتزاز قوي لمدة دقيقة واحدة بين الغسيل. قم بإزالة الماء ، بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت 2 ، المسخن مسبقا عند 50 درجة مئوية إلى الدرج ، ثم احتضان وغسل صانع البئر كما هو موضح سابقا للمخزن المؤقت 1. بعد ذلك ، اغسل صانع البئر بنسبة 70٪ من الإيثانول ، مع اهتزاز قوي لمدة دقيقة واحدة واستخدم الهواء المضغوط للسماح للإعداد بالجفاف.
لإجراء التهجين ، أضف أربعة ميكرولتر من خليط الدائرة المحضر إلى كل بئر مطابق وضع صانع البئر في غرفة رطوبة بالماء المقطر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، اغسل صانع البئر لمدة دقيقة واحدة لكل منهما والمخزن المؤقت 3 والمخزن المؤقت 4 و 70٪ من الإيثانول ، ثم اتركه يجف في الهواء. تحضير وإضافة أربعة ميكرولتر من خليط RCA إلى كل بئر من صانع البئر ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين في غرفة الرطوبة.
لتصور منتجات دائرة الدرفلة الفلورية المضخمة مجهريا ، أولا ، اغسل الشريحة باستخدام المخزن المؤقت 3 والمخزن المؤقت 4 والإيثانول 70٪. جفف الشريحة بالهواء المضغوط وألصقها على شريحة مجهرية. حدد موضع الآبار بعلامة ثم قم بإزالة شبكة السيليكون باستخدام الملقط.
للسماح بالتصور في الكاميرا ، قم بتركيب الشريحة باستخدام ميكرولترين من وسيط التثبيت بدون dapi وأضف غطاء زجاجي. قم بتحليل الشريحة باستخدام مجهر مضان ، مع عدسة موضوعية للغمر بالزيت 60x وكاميرا. بعد التصوير ، قم باستيراد الصور إلى الصورة J وقم بتكديس الصور بالنقر فوق صورة ، ثم مكدسات وصور إلى مكدس ، ثم قم بتغيير نوع الصورة إلى 8 بت.
لتعيين العتبة ، انقر فوق صورة ، ضبط ثم عتبة. اضبط الشريط السفلي على 255 واضبط الشريط العلوي بحيث تكون الإشارات الصحيحة فقط حمراء والخلفية سوداء. قم بمسح الصور الفردية وتأكد من توافقها مع الصور قبل ضبط العتبة.
تأكد من تعيين الحد الأدنى عند أدنى مستوى ممكن قبل أن تبدأ الإشارات الحقيقية في الاختفاء. لحساب الإشارات، انقر فوق تحليل، متبوعا بتحليل الجسيمات وتأكد من تحديد الحقل الملخص في إعدادات الصورة J. أضف أربعة ميكرولترات من الجسم المضاد المضاد للبيوتين المقترن بفجل الحصان المخفف إلى كل بئر واحتضانه عند 15 إلى 25 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة في غرفة الرطوبة.
في نهاية الحضانة ، اغسل صانع البئر ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت 5 لمدة ثلاث دقائق لكل منهما واتركه يجف. لتصور التلألؤ الكيميائي ، أضف ميكرولترين من لومينول ECL الطازج ومزيج بيروكسيد الهيدروجين إلى الآبار وتصور الشريحة باستخدام كاميرا CCD أو على أفلام الأشعة السينية. بدلا من ذلك ، للتصور باستخدام TMB ، قم بإزالة شبكة السيليكون بعد غسل المخزن المؤقت 5 وإضافة 400 ميكرولتر من TMB أعلى الشريحة بأكملها.
احتفظ بالشريحة في غرفة الرطوبة وانتظر لمدة خمس إلى 10 دقائق لتطوير اللون. بعد تطوير اللون ، اغسل الشريحة بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتصوير الشريحة بكاميرا أو هاتف محمول لتحليلها باستخدام برنامج الصورة J. قم باستيراد الصورة إلى الصورة J وقم بتغيير نوع الصورة إلى 8 بت بالنقر فوق نوع الصورة ثم 8 بت.
حدد المساحة المقاسة باستخدام أداة رسم المستطيل من شريط الأدوات لقياس النطاقات بشكل منفصل ورسم المساحة المطلوبة. قم بقياس الكثافة بالنقر فوق وتحليل ثم القياس. بعد ذلك ، انقل المنطقة المرسومة أصلا إلى النطاق التالي وقم بالقياس.
بعد قياس شدة جميع النطاقات ، ارسم البيانات في البرنامج المطلوب. يتم تصوير نشاط Topoisomerase 1 كما هو محدد بواسطة قراءة الماسح الضوئي الفلوري هنا ، كما يتضح من القياس الكمي. هذه القراءة لها حد كشف يبلغ 12.5 نانوجرام ، والصور التمثيلية والقياس الكمي الناتج الذي تم الحصول عليه باستخدام قراءات المجهر الفلوري ، موضحة هنا.
تحتوي طريقة القراءة هذه على حد كشف يبلغ 0.1 نانوجرام ، وكانت عتبة الكشف عن التلألؤ الكيميائي المحسن وطرق قراءات الألوان 6 نانوجرامات. باستخدام نفس القراءات ، كان حد الكشف 1،250 خلية ل ECL و 312 خلية ل TMB. عندما تم قياس نشاط توبويزوميراز 1 من مقتطفات من الخلايا المشتقة من سرطان القولون والمستقيم.
كمثال على تطبيق فحص المخدرات ، تم قياس نشاط توبويزوميراز 1 في وجود كامبتوثيسين أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد. أظهرت نتائج القياس الكمي أن كامبتوثيسين يثبط توبويزوميراز 1 واحد بوساطة دائرية للركيزة كما هو متوقع. هذا بروتوكول بسيط لا يتطلب سوى اهتمام خاص بخطوات الغسيل وأوقات حضانة التفاعل.
من الممكن أيضا التحقيق في كيفية تثبيط الأدوية لنشاط توبويزوميراز 1 ، باستخدام ريد حساس للغاية وسهل الأداء ، فهو يسمح بالفحص السريع لمثبطات توبويزوميراز 1 المحتملة ، واستخدام نشاط توبويزوميراز 1 كمؤشر حيوي للاستجابة الدوائية في السرطانات.
