長期培養のためのヒト心筋組織の作製

このプロトコールを用いて、ヒト左心室組織切片を生体模倣チャンバー内でエキソビボで培養することができる。前負荷と後負荷の適用は、生理学的環境の類似性を改善する。この技術は、組織収縮の連続的な登録を可能にする。

ユーザー定義の刺激プロトコルにより、一時停止後の増強、刺激閾値、力と周波数の関係、耐火期間などの重要な収縮パラメータの評価が可能になります。このセットアップを使用した心筋スライスの長期培養は、将来のエクスビボ研究への道を開き、心血管医学における治療的および心毒性薬物効果のスクリーニングを容易にする。まず、培養チャンバとグラファイト電極を1リットルの10%イソプロパノール溶液に沈め、一晩攪拌します。

翌日、チャンバを100%イソプロパノール溶液に3分間移し、チャンバおよびグラファイト電極を層流フードの下で風乾させる。ロッカーの使用可能な位置に応じて、各チャンバーに回路基板を取り付けます。製造元の指示に従って回路基板に2つのグラファイト電極を置き、感染を防ぐために35ミリメートルのペトリ皿の蓋をチャンバーに置きます。

次に、切断トレイをスライスバッファーで最大90〜95%まで満たします。組織サンプルをコールドスライスバッファーで満たされた100ミリメートルのペトリ皿に移し、皿を摂氏4度の冷却プレートの上に置きます。ピンセットで心内膜を保持して心内膜線維柱帯を除去し、はさみを使用して心内膜組織の約3ミリメートルを切り取る。

切断した組織サンプルを、正方形の位置に固定された4本の0.9 x 70ミリメートルの20ゲージ針を使用して、心内膜側を2 x 2 cmのゴムパッチまで固定します。各針先の対角線の端が内側を向いていることを確認し、固定を強化し、心筋の損傷を防ぎます。メスを使用して、4つの針の正方形の外側にある余分な組織をすべて切り取ります。

ピンセットを使用して、トリミングしたサンプルを滅菌組織片に10秒間置き、余分なスライスバッファーを除去します。次に、アガロースシリンジをウォーターバスから取り出し、サンプルをアガロースに沈める。アガロースを冷却プレート上で5分間固化させます。

サンプルの心内膜側はアガロースで見えなければなりません。ピンセットを使用して、アガロースに含まれるサンプルの心外膜側を接着領域の上に置き、アガロースを切断または損傷することなく、鈍い工具でアガロース含有サンプルを上から静かに押します。接着剤を1分間固めます。

振動振幅を1ミリメートル、初期切削速度を毎秒0.07ミリメートル、スライスの厚さを300ミクロンに設定します。栽培システムをコンピュータに接続した後、対応するソフトウェアプログラムを起動します。ロッカーの速度を60rpmに設定し、刺激パラメータをプリセットします。

ヒトの心臓スライスの場合、標準刺激を、50ミリアンペアまたは3ミリ秒の正電流、1ミリ秒の一時停止、および3ミリ秒の反転電流パルスからなる電流の二相性インパルスに設定し、毎分30ビートまたはbpmのペーシングレートで、ソフトウェアの電極インジケータをチェックし、栽培室の電極が正しく機能していることを確認します。ピンセットを使用して、アガロースを組織から分離する。組織に触れないようにし、組織への損傷は栽培の成功率を低下させるので慎重に取り扱います。

サンプルに2つのプラスチック製の三角形を取り付けるには、滅菌ペトリ皿の蓋に1マイクロリットルの接着剤を置きます。フックピンセットを使用して、オートクレーブ処理されたプラスチック製の三角形を1つ拾います。三角形の前端を接着剤に素早く浸し、心筋細胞のアライメントに垂直なサンプルに三角形を貼り付けます。

もう一方の三角形についても同じ手順を繰り返します。メスを使用して、三角形の幅を超える組織をトリミングし、2つの三角形が取り付けられたスライスをスライスバッファーを含む切断トレイに戻します。培地充填培養チャンバーをインキュベーターから取り外します。

用意したスライスを1つ選択し、各ピンに1つの三角形を接続してチャンバに挿入します。取り付けピン間の距離をサンプルサイズに合わせて調整します。サンプルが培地に沈んでいることを確認します。

皿をロッカーに置いた後、コンピュータ画面上の対応するグラフのベースラインがもう変わらなくなるまで調整ネジを反時計回りに回して予荷重を下げ、調整ネジを時計回りに回して予荷重または張力を慎重に上げます。剛性の高いチャンバの場合、グラフ内の対応するベースラインが 1 ミリニュートンの予荷重に対応する 1,000 ~ 1,200 単位増加するまで続けます。新鮮な栽培培地を調製した後、37°Cのウォーターバスまたは熱風インキュベーターで培地を30〜45分間予備温める。

チャンバーから培地を取り出し、チャンバー内に約0.8ミリリットルを残してから、同じチャンバーに1.6ミリリットルの新鮮な培地を加え、チャンバーあたり2.4ミリリットルの培地の総容量を作ります。最後に、チャンバーのカバーを背面に置き、栽培チャンバーをそれぞれの位置に置きます。典型的な刺激中の5つの心筋スライスの収縮の読み出しは、一時停止後の増強、刺激閾値、力 - 周波数関係、および耐火期間の4つの異なるセクションから成っていた。

対照と比較して、カルシウムアンタゴニスト、ニフェジピンおよびカルシセプチンで処理したスライスの収縮力は、10分以内に減少した。対照的に、電位依存性カルシウムチャネルアゴニストBay-K8644は、収縮力を増加させた。対照および処置切片の休止後増強を、筋小胞体からの細胞内カルシウム放出について評価した。

コントロールスライスに変更が表示されませんでした。カルシセプチンおよびニフェジピンの存在下では、L型カルシウムチャネルの阻害は、50秒の一時停止後の最初の収縮の増強をもたらし、全収縮性に対する細胞内カルシウム放出のより高い相対的寄与を反映した。反対の効果は、L型カルシウムチャネルを介した細胞外カルシウムの侵入を刺激するBay-K8644で観察された。

力-頻度関係解析では、コントロールスライスに変化は認められなかった。カルシセプチン処置は、処置前および治療後のデータを比較したときの刺激頻度の増加時に刺激に従うスライスの能力を変化させなかった。カルシセプチンと比較して, ニフェジピンは、より高いペーシング速度で収縮性の増加を防止し、で最大捕捉率を低下させました 80 bpm.

Bay-K8644では、非常に低い刺激周波数で収縮力の増加が観察された。しかし、50bpmより高い周波数では、収縮力は前処理条件時よりも低かった。摘出した組織は、速やかに4度の心筋麻痺に移すべきである。

スライス後、プラスチック三角形をファイバー方向に垂直に取り付ける必要があります。プリロードは1500ミリニュートンを超えてはなりません。生体模倣スライス培養は、研究者が成人ヒト心筋の再生と修復を研究するための遺伝子操作および細胞ベースの治療法を利用するのに役立ちます。