このプロトコルは、蚊関連ウイルスを分離するための有用なアプローチであり、蚊に関連する病原体の分布と蚊媒介性疾患の制御に関するさらなる研究に役立ちます。バイオセーフティレベル2のラボで細い線を使用してウイルスを分離することは、より安全で効率的です。さまざまな液体で赤色接種を循環させるなどの他のウイルス分離手順とは異なり、この技術は動物実験や倫理的評価を必要としません。
インキュベーション中にサンプルや細胞が引き込まれる汚染は、実験の失敗につながる可能性があります。したがって、汚染を防ぐために、2%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンを培地に添加する必要があります。氷の上に置いた2ミリリットルの滅菌チューブに3ミリメートルのセラミックビーズ、2%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液を添加した1.5ミリリットルのRPMI培地を添加し、その中に50匹の蚊を移します。
次に、低温組織ホモジナイザーで蚊をホモジナイザーで70ヘルツ、摂氏4度で30秒間3サイクル粉砕します。ホモジネートを摂氏4度で30分間15, 000 Gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。蚊の破片を完全に除去するには、上清を15, 000 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。
上清P0200マイクロリットルを2ミリリットルのスクリューキャップ保存チューブに分注し、マイナス80°Cで保管します。ウイルス増幅には、ネッタイシマカRNAi欠損蚊細胞株C6/36と脊椎動物細胞株、ベビーハムスター腎臓、または75センチメートル四方のフラスコからのBHK-21を使用し、それらを24ウェルプレートに別々に播種します。播種した24ウェルプレートを摂氏28度または37度で一晩置きます。
翌日、細胞を顕微鏡下で観察し、各ウェルの80〜90%コンフルエントを確認した。抗生物質を添加した500ミリリットルの細胞培養維持培地を調製する。24ウェルプレートから細胞培養培地を取り出し、各ウェルに100マイクロリットルの細胞培養維持培地を加えます。
次いで、蚊ホモジネートまたはP0の上清100マイクロリットルを細胞に接種する。プレートを摂氏28度または37度で60分間インキュベートし、細胞の乾燥を防ぐために15分ごとにプレートを静かに振ってください。完了したら、上清を取り除き、600マイクロリットルの細胞培養維持培地で各ウェルをすすぎ、破片を完全に除去します。次に、800マイクロリットルの細胞培養維持培地を各ウェルに加え、プレートを摂氏28度または37度の5%二酸化炭素加湿インキュベーターに7日間入れます。
顕微鏡下で各ウェルの細胞の状態を毎日監視する。7日目に、P1と呼ばれる細胞の上清を集め、摂氏マイナス80度で保存します。この手順を繰り返して、P2およびP3ウイルス上清を収集します。
細胞病原性効果(CPE)により、いくつかのウェルからの細胞は死滅し、表面から剥離する。ウイルスを大幅に増幅するには、CPE効果を示すウェルから300〜400マイクロリットルの上清を収集し、培養細胞の80〜90%の細胞コンフルエンシーを持つ新しい6ウェルプレートに移します。最後に、500マイクロリットルの上清を6ウェルプレートのウェルから2ミリリットルのスクリューキャップ保存チューブに移してから、マイナス80°Cで保存します。
C6/36細胞に蚊ホモジネートP0を接種したところ、未接種または対照細胞と比較して、感染後120時間で剥離細胞に広い細胞間空間が見られました。BHK21細胞とP3ウイルス上清とのインキュベーションは、感染後48時間で目に見えるCPEを示し、対照細胞とは対照的に、細胞の死と表面からの剥離を示しました。市販のユニバーサルプライマーまたはフラビウイルス、アルファウイルスおよびブニヤウイルスを使用して、ウイルス上清用のPCR産物を生成した。
ブニヤウイルスのPCR産物であるエビヌール湖ウイルスをポジティブコントロールとして設定しました。ブニヤウイルスに属するレーンでのPCR増幅禁止とポジティブコントロールは、上清中にブニヤウイルスが存在する可能性を強調しました。ウイルス分離の成功率を向上させるには、サンプルの輸送、分離、および粉砕中に低温を保ちます。
蚊と培養物を均質化するときに抗生物質を追加します。そして、培養液を除去してインキュベーション中に培養物を迅速に処理する。この手順に加えて、粉砕溶液をサイクリングラットまたはニワトリ胚に注入することができる。
ただし、肯定手順は倫理的な懸念を引き起こし、実験の費用を増加させます。
