Dieses Protokoll ist ein nützlicher Ansatz zur Isolierung von Mücken-assoziierten Viren und kann bei der weiteren Erforschung der Verbreitung von Krankheitserregern im Zusammenhang mit Stechmücken und der Kontrolle von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten helfen. Die Verwendung dünner Linien zur Isolierung von Viren im Labor der Biosicherheitsstufe 2 ist sicherer und effizienter. Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Virusisolierung, wie z. B. der zyklischen Rotimpfung mit unterschiedlicher Flüssigkeit, sind bei dieser Technik keine Tierversuche oder ethische Bewertungen erforderlich.
Die Kontamination durch die Proben und die Entnahme der Zellen während der Inkubation kann zum Scheitern des Experiments führen. Daher ist es notwendig, dem Medium 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin zuzusetzen, um eine Kontamination zu vermeiden. Beginnen Sie mit der Zugabe von drei Millimeter dicken Keramikkügelchen, 1,5 Milliliter RPMI-Medium, ergänzt mit 2%Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-B-Lösung in einem sterilen Zwei-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gelegt wird, und übertragen Sie dann 50 Mücken darin.
Als nächstes homogenisieren Sie die Mücken mit einem Niedertemperatur-Gewebehomogenisator, indem Sie 30 Sekunden lang bei 70 Hertz und 4 Grad Celsius für 3 Zyklen mahlen. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 15.000 G für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius und übertragen Sie die Überstände in die neuen Röhrchen. Um die Mückenreste vollständig zu entfernen, zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 15.000 G für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Aliquotieren Sie die 200 Mikroliter Überstand P0 in ein zwei Milliliter fassendes Schraubverschluss-Vorratsröhrchen und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie für die Virusamplifikation die Aedes albopictus RNAi-defiziente Mückenzelllinie C6/36 und eine Wirbeltierzelllinie, eine Babyhamsterniere oder BHK-21 aus einem 75-Zentimeter-Quadratkolben und säen Sie sie separat in 24-Well-Platten. Stellen Sie die entkernte 24-Well-Platte über Nacht bei 28 oder 37 Grad Celsius auf.
Beobachten Sie die Zellen am nächsten Tag unter dem Mikroskop, um eine Konfluenz von 80 bis 90 % in jeder Vertiefung zu bestätigen. Bereiten Sie 500 Milliliter des mit Antibiotika ergänzten Zellkultur-Erhaltungsmediums vor. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus den 24-Well-Platten und geben Sie 100 Mikroliter des Zellkultur-Pflegemediums in jede Well.
Anschließend beimpfen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern des Überstandes des Mückenhomogenats oder P0. Inkubieren Sie die Platten 60 Minuten lang bei 28 oder 37 Grad Celsius und schütteln Sie die Platten alle 15 Minuten vorsichtig, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand und spülen Sie jede Vertiefung mit 600 Mikrolitern Zellkultur-Pflegemedium, um den Schmutz vollständig zu entfernen. Als nächstes geben Sie 800 Mikroliter Zellkultur-Pflegemedium in jede Vertiefung, bevor Sie die Platten 7 Tage lang in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 28 oder 37 Grad Celsius stellen.
Überwachen Sie täglich den Zustand der Zellen jedes Brunnens unter dem Mikroskop. Sammeln Sie am siebten Tag den Überstand der Zellen, die als P1 bekannt sind, und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Vorgang, um virale P2- und P3-Überstände zu sammeln.
Aufgrund der zytopathogenen Wirkung (CPE) sterben Zellen aus einigen der Vertiefungen ab und lösen sich von der Oberfläche. Um die Viren stark zu vermehren: Sammeln Sie 300 bis 400 Mikroliter des Überstands aus Vertiefungen, die den CPE-Effekt zeigen, und übertragen Sie ihn auf eine neue Sechs-Well-Platte mit einer Zellkonfluenz von 80 bis 90 % der Kulturzellen. Zum Schluss werden 500 Mikroliter des Überstands aus den Vertiefungen der Sechs-Well-Platte gesammelt und in Zwei-Milliliter-Schraubdeckel-Speicherröhrchen umgefüllt, bevor sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.
Die Inokulation von C6/36-Zellen mit den Mückenhomogenaten P0 zeigte 120 Stunden nach der Infektion einen großen interzellulären Raum in exfoliierten Zellen im Vergleich zu den nicht inokulierten oder Kontrollzellen. Die Inkubation von BHK21-Zellen mit den P3-Virusüberständen zeigte 48 Stunden nach der Infektion ein sichtbares CPE, das im Gegensatz zu den Kontrollzellen das Absterben der Zelle und die Ablösung von der Oberfläche zeigte. Zur Herstellung der PCR-Produkte für den viralen Überstand wurden kommerziell erhältliche Universalprimer oder Flaviviren, Alphaviren und Bunyaviren verwendet.
Ein PCR-Produkt für das Bunyavirus, das Ebinur-Lake-Virus, wurde als Positivkontrolle festgelegt. Die PCR-Amplifikationsverbote in den Bahnen von Bunyaviren und die Positivkontrolle unterstrichen die Möglichkeit des Vorhandenseins von Bunyavirus in den Überständen. Um die Erfolgsrate der Virusisolierung zu verbessern, halten Sie die Temperatur während des Probentransports, der Isolierung und des Mahlens niedrig.
Fügen Sie Antibiotika hinzu, wenn Sie die Mücken und die Kultur selbst homogenisieren. Und handhaben Sie die Kultur schnell während der Inkubation und der Entnahme des Nährmediums. Zusätzlich zu diesem Verfahren kann die Mahllösung in einen zyklischen Ratten- oder Hühnerembryo injiziert werden.
Das Bestätigungsverfahren wird jedoch ethische Bedenken aufwerfen und die Kosten des Experiments erhöhen.
