このプロトコルは、Sf9バキュロウイルスシステムを使用して活性分子モーターを精製するための簡単な方法を提供します。また、モータータンパク質の調節メカニズムを研究するための単一分子運動およびマルチモーターグライディングアッセイについても詳しく説明します。従来のベクター発現Sf9バキュロウイルス発現とシングルステップアフィニティー精製はすべて、純粋で活性なモータータンパク質を、単一分子およびマルチモーターシステムにおけるスーパープロセシティブキネシンの機構の詳細を研究するように導きます。
キネシンモーターに加えて、このプロトコルは、ジオニンやミオシンなどの他の細胞骨格ベースのタンパク質の生化学的および生物物理学的特性の研究に適用できます。プロトコルは詳細でわかりやすいです。いくつかの提案は、Sf9細胞は汚染されやすいため慎重に取り扱い、プロトコルで提供されているメモに従うことです。
視覚的なデモンストレーションは非常に効果的で、特にこれらのアッセイを実行したことがない人にとって、重要なステップに従いやすく理解しやすいです。手順を実演するのは、私とプラディープ・ナイクと一緒に働いている博士課程の学生であるプシュパンジャリ・ソッピーナとディペシュワリ・シェワレです。はじめに、細胞を35ミリリットルの皿に、1ミリリットルあたり10から5番目の細胞に4.5倍の密度で播種します。
24時間後、1マイクログラムのバクミドDNAと100マイクロリットルの未添加グレース培地をチューブに入れて混合します。6マイクロリットルのトランスフェクション試薬を別のチューブに入れて、100マイクロリットルの未添加のグレース培地と混合します。最初のチューブの内容物を2番目のチューブに慎重に移します。
それらを混合し、室温で45分間混合物をインキュベートする。0.8ミリリットルの未添加グレース培地を混合物に加える。細胞からSf900 SFM培地を混合して吸引します。
調製したトランスフェクション培地を細胞の上部に滴下し、プレートを6時間インキュベートします。その後、トランスフェクション混合物を慎重に除去します。2ミリリットルのSF900 SFM培地を加え、さらに摂氏28度で48時間インキュベートします。
次に、倒立蛍光顕微鏡でモータータンパク質発現を確認する。感染した細胞を含む培地を回収し、500 Gで5分間回転させ、上清を収集し、アリコートをスナップフリーズします。細胞を含む10ミリリットルのSF900 SFM培地と1ミリリットルのPゼロウイルスストックを、滅菌済みの100ミリリットルの円錐フラスコに入れます。
摂氏28度でインキュベートし、90rpmで絶えず振とうします。72時間後、15ミリリットルの滅菌コニカルチューブで500 Gで5分間細胞をスピンダウンし、上清を収集します。大規模なタンパク質発現のために、30ミリリットルの浮遊培養物を1ミリリットルのP1ストックウイルスに感染させます。
感染後72時間で、細胞のタンパク質発現をチェックし、滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に細胞を採取します。紡糸後、上清を捨て、細胞ペレットを回収する。細胞を溶解するには、3ミリリットルの氷冷溶解バッファーを細胞ペレットに加えます。
細胞溶解液を150, 000 Gで摂氏4度で30分間回転させます。上清を採取し、40マイクロリットルの50%ANTI-FLAG M2アフィニティ樹脂と混合します。混合物を摂氏4度で3時間インキュベートし、エンドツーエンドのタンブリングを行います。
次に、摂氏4度で500Gで1分間回転させてFLAG樹脂をペレット化します。FLAG樹脂ペレットを氷冷洗浄バッファーで3回洗浄します。そして、3回目の洗浄後、洗浄バッファーを慎重に排出します。
次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのFLAGペプチドを含む70マイクロリットルの洗浄バッファーを樹脂ペレットに加え、前述のように摂氏4度で一晩インキュベートします。紡糸後、精製タンパク質を含む上清を新鮮なチューブに集める。原稿に記載されているように重合混合物を調製し、重合混合物に10マイクロリットルのチューブリンを加える。
チューブをヒートブロックに移し、摂氏37度に予熱し、30分間インキュベートします。微小管安定化バッファーを調製した後、それを温め、重合した微小管に加える。運動性フローセルチャンバーが準備されたら、30マイクロリットルの希釈微小管溶液をチャンバーに流します。
30分後、40〜50マイクロリットルのブロッキングバッファーを流し、インキュベートします。運動性混合物を調製し、それに1マイクロリットルの精製モーターを加える。よく混合し、溶液を運動チャンバーに流します。
運動チャンバーの両端をTIRF照明下で密封し、画像を密封する。個々のmCitirineタグ付きモーターに焦点を当て、処理的に動きます。ローダミン標識チューブリンと非標識チューブリンを1対10の比率で混合します。
30分間の重合後、予め温めた微小管安定化バッファー30マイクロリットルを穏やかに加え、さらに摂氏37度で5分間インキュベートします。毛細管ローディングチップでピペッティングして微小管をせん断します。運動性フローチャンバーを調製した後、50マイクロリットルのSf9精製GFPナノボディを流し、30分間インキュベートする。
50マイクロリットルのブロックバッファーを流してカバースリップ面をブロックします。50マイクロリットルのモーターミックスを準備します。溶液を穏やかに混合した後、それをチャンバーに流し、30分間インキュベートする。
チャンバーを50マイクロリットルのP12-カゼインで2回洗浄します。グライディングアッセイ混合物を調製し、穏やかに混合してから、運動チャンバーに流します。運動性チャンバーの端部をシールし、TIRF照明下で微小管を滑走させる画像を撮影した。
トランスフェクションから 48 時間後、トランスフェクションされていない細胞は小さく、丸く、しっかりと付着しているように見えます。しかし、タンパク質を発現するトランスフェクトされた細胞は、表面に緩く付着し、拡大した細胞径を示した。72時間後、Sf9細胞の90%以上が蛍光タグ、キネシン-3モーターKIF1Aを発現し、細胞は表面に緩く結合した。
キネシン-3モータータンパク質は、トランスフェクトされたSf9細胞から精製されました。キモグラフは、微小管表面に沿ってキネシン-3モーターが処理的に歩く様子を描いています。運動イベントは、それぞれ毎秒約2.44マイクロメートルと10.79マイクロメートルの平均速度と実行長を示しました。
キモグラフは、キネシン-3モーターによる滑らかな微小管滑走を示し、平均速度は約1.37マイクロメートル/秒です。最も重要なことは、微小管ミックスを乱すことなく安定化バッファーを添加し、微小管を剪断しないことです。このプロトコルは、ATPase測定、生物物理学的分析、メカニズム、in vitro再構成アッセイなどの他のアプリケーションに役立ちます。
sf9精製モーターを使用して、最近、kinesin-3モーターが高速で超処理可能であることを実証しました。興味深いことに、これらのモーターは、特性の良いモーターであるKinesin-1と比較して、高いATP回転率を示します。
