このプロトコルは、マイクロRNAなどの特定の因子で処理した後に網膜前駆細胞に変換するミュラーグリアの可能性と能力を研究することを可能にします。この技術の利点は、マイクロRNA候補をin vivoアプリケーションで使用する前に、その効率と結果をテストできることです。手順のデモンストレーションを支援するのは、ステファニー・ウォルの研究室の博士課程の学生であるソヨン・カンです。
まず、動物からの細菌の持ち越しを避けるために、除去した眼球をエタノールを含むチューブに短時間浸します。次に、氷上の24ウェルプレートに入れる前に、10センチメートルのペトリ皿で眼球を簡単に洗います。眼球を取り外して洗浄したら、光源付きの解剖顕微鏡の下に置かれた解剖皿に片目を置きます。
次に、デュモン5の細かい鉗子で強膜の周りの視神経と周囲の結合組織をつかんで片眼球を固定し、解剖皿に注意深く押し付けます。次に、30ゲージの針を使用して角膜中央に穴を開け、静脈ハサミにアクセスしやすくします。次に、静脈ハサミを使用して毛様体の周りの角膜を解剖し、デュモン5細鉗子で角膜、水晶体、虹彩、硝子体を慎重に取り除きます。
その後、視神経に達するまで静脈ハサミで強膜を解剖し、デュモン5ファイン鉗子を使用して網膜を注意深く抽出します。次に、2番目のDumont 5ファイン鉗子を使用して網膜を押し、硝子体を完全に取り除きます。滅菌トランスファーピペットの先端の約2.5センチメートルに切断した網膜を移し、直径を拡大する。
このチップを使用して、組織を損傷することなく網膜全体を拾い上げ、網膜を冷たいHBSSを備えた新しい滅菌ペトリ皿に移し、皿を揺り動かします。次に、新しい滅菌トランスファーピペットを用いて、網膜を慎重に押し回し、網膜色素上皮細胞を洗い流す。単離された網膜を、解剖中に24ウェルプレートを氷上に保ちながら、1ミリリットルのHBSSで満たされた24ウェルプレートの新しいクリーンウェルに直ちに配置します。
パパインDNase I解離混合物を原稿に記載されているように調製する。拡大したチップトランスファーピペットで、網膜を拾います。網膜が先端の底に落ち着くまで待ち、過剰なHBSSなしで網膜をパパインDNase I混合物を含むチューブに放出します。
次に、チューブをインキュベーター内のニューテーターに置き、摂氏37度で5%二酸化炭素で10分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのピペットで慎重に上下にピペッティングして細胞を解離します。細胞が解離した後、パパイン解離キットから275マイクロリットルのオボムコイドプロテアーゼ阻害剤を加えてパパインを中和し、上下にピペッティングして穏やかに混合します。
チューブを遠心分離機に入れ、摂氏4度で相対遠心力300で8分間回転させます。摂氏37度に予熱した成長培地の計算量に上皮成長因子を加える。チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。
チューブの底にあるペレットに触れることなく、上清を注意深く完全に取り除きます。次に、細胞ペレットを500マイクロリットルの上皮成長因子補充増殖培地で再懸濁します。次いで、細胞懸濁液を標識した12ウェルプレートの1ウェルに移す。
さらに500マイクロリットルの上皮成長因子を添加した増殖培地でチューブをすすぎ、ウェルに加えます。ウェルプレートを注意深く揺り動かし、二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターにプレートを置きます。90%から100%のセルコンフルエンシーをチェックすることから始めます。
次に、培地を取り出し、1ミリリットルの冷たいHBSSを加えて井戸を洗います。プレートをそっと揺り動かし、痕跡を残さずにHBSSを取り外します。その後、500マイクロリットルの予め温めたトリプシン含有溶液を加えて、細胞をウェルから剥離する。
穏やかに揺り動かし、摂氏37度のインキュベーターで2分間インキュベートします。プレートをインキュベーターからバイオ安全キャビネットに移動した後、傾けながらトリプシン含有溶液を吸引します。細胞が完全に剥離するまで、ウェル上に数回注意深くゆっくりと分散させます。
次に、この細胞懸濁液を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移し、チューブを遠心分離機に入れます。摂氏4度で8分間300倍gで回転し、チューブをバイオ安全キャビネットに戻します。ペレットに触れずに上清を取り除きます。
次に、600マイクロリットルの事前に温めた増殖培地を追加し、約30〜40回上下にピペッティングすることにより、細胞ペレットを注意深く再懸濁します。最後に、得られた細胞懸濁液100マイクロリットルを24ウェルプレートの6つのコーティングカバースリップの中央に播種する。プレートをインキュベーターに置き、マイクロRNA模倣物を使用して細胞を沈降させ、その後のトランスフェクションを行います。
この図は、トランスフェクションの5日後に、いくつかのAscl1-Tomato陽性細胞が存在する対照条件を示しています。しかし、miR-25処理後、さらに多くのAscl1-トマト陽性細胞が見つかります。定量により、miR-25処理ウェルのAscl1-Tomato陽性細胞数が対照と比較して4倍に増加したことが明らかになりました。
最も重要なことは、riR-25処理ウェルで見つかったAscl1-トマト陽性細胞の大部分がニューロン形態を採用していることです。このニューロン形態の特徴には、細胞体細胞サイズの縮小、微細なプロセスの発達、および小さなネットワークの形成が含まれていました。定量の結果、Ascl1-Tomato陽性細胞の約70%が神経細胞の特徴を持っていることが明らかになりました。
免疫蛍光標識により、神経形態を有するAscl1-Tomato陽性細胞が神経マーカーOTX2およびMAP2を発現し、神経細胞の同一性を確認することが示されました。これらの細胞の定量により、miR-25過剰発現後、対照では1視野あたり5個の神経細胞と比較して、1視野あたり約40個のAscl1-Tomato陽性ニューロンが存在することが明らかになりました。同定された神経細胞は、miR-25処理サンプルの全Ascl1-Tomato陽性細胞集団の約70%を構成します。
さらに、OTX2およびMAP2共発現ニューロンの絶対数の定量化は、miR−25処理後、対照における1野当たり10ニューロンと比較して、野当たり約60ニューロンが見出されたことを示した。清潔で無菌の道具を使って清潔で消毒された環境で作業し、過酷な治療を避けて慎重に作業することが不可欠です。ダウンストリームアプリケーションは、例えば、タンパク質定量、DNAまたはRNA分析、または電気生理学的研究であり得る。
この手法は、再生医療の分野に属する核初期化に関する最初の疑問を探求するのに役立ちました。そして、新しい質問を探求するためにテストできる要因と条件は長々とあります。
