يسمح هذا البروتوكول بدراسة إمكانات وقدرة دبقية مولر على التحول إلى خلايا سلف شبكية العين بعد العلاج بعوامل محددة مثل الحمض النووي الريبي الميكروي. ميزة هذه التقنية هي أنه يمكن اختبار مرشحي الحمض النووي الريبي الميكروي لكفاءتهم ونتائجهم قبل استخدامهم في تطبيقات الجسم الحي. سيساعد في إثبات الإجراء سيويونغ كانغ ، طالب الدكتوراه من مختبر ستيفاني وول.
أولا ، اغمس مقلة العين التي تمت إزالتها لفترة وجيزة في أنبوب به إيثانول لتجنب ترحيل البكتيريا من الحيوان. ثم اغسل مقلة العين لفترة وجيزة في طبق بتري الذي يبلغ طوله 10 سنتيمترات قبل وضعه في طبق البئر المكون من 24 بئرا على الجليد. بمجرد إزالة مقل العيون وتنظيفها ، ضع عين واحدة في طبق التشريح الموضوع تحت مجهر تشريح مع مصدر ضوء.
الآن قم بإصلاح مقلة عين واحدة عن طريق الإمساك بالعصب البصري والنسيج الضام المحيط حول الصلبة باستخدام ملقط Dumont 5 الناعم والضغط عليه بعناية ضد طبق التشريح. بعد ذلك ، قم بعمل ثقب في مركز القرنية باستخدام إبرة قياس 30 للسماح بوصول أسهل للمقص الوريدي. ثم ، قم بتشريح القرنية حول الجسم الهدبي باستخدام مقص وريدي وقم بإزالة القرنية والعدسة والقزحية والجسم الزجاجي بعناية باستخدام ملقط Dumont 5 الدقيق.
في وقت لاحق تشريح الصلبة مع مقص وريدي حتى يتم الوصول إلى العصب البصري واستخراج بعناية شبكية العين باستخدام ملقط دومون 5 دقيقة. الآن استخدم ملقط Dumont 5 الناعم الثاني للدفع ضد شبكية العين وإزالة الجسم الزجاجي بالكامل. نقل الشبكية قطع حوالي 2.5 سم من طرف ماصة نقل معقمة لتكبير القطر.
الآن باستخدام هذه النصيحة ، التقط شبكية العين بأكملها دون إتلاف الأنسجة وانقل الشبكية إلى طبق بتري معقم جديد مع HBSS البارد وهز الطبق. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل معقمة جديدة ، ادفع الشبكية بعناية لغسل الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية. ضع شبكية العين المعزولة على الفور في بئر نظيفة جديدة من صفيحة البئر 24 المملوءة بملليلتر واحد من HBSS مع الحفاظ على صفيحة البئر 24 على الجليد أثناء التشريح.
تحضير خليط التفكك الصبغي DNase I كما هو موضح في المخطوطة. الآن مع ماصة نقل طرف مكبرة ، التقط شبكية العين. انتظر حتى تستقر الشبكية في الجزء السفلي من الطرف وحرر الشبكية دون HBSS المفرط في الأنبوب الذي يحتوي على خليط Papain DNase I.
بعد ذلك ، ضع الأنبوب على جوزة في الحاضنة واحتضنها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ومع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بفصل الخلايا عن طريق السحب بعناية لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة ملليلتر واحدة. بعد انفصال الخلايا ، أضف 275 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني البويضي من مجموعة تفكك Papain لتحييد Papain وتخلط بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي وتدور عند أربع درجات مئوية لمدة ثماني دقائق بقوة طرد مركزي نسبية تبلغ 300. أضف عامل نمو البشرة إلى الحجم المحسوب لمتوسط النمو الذي تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.
دون لمس الكريات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب ، قم بإزالة supernatant بعناية وبشكل كامل. الآن إعادة تعليق بيليه الخلية مع 500 ميكرولتر من عامل نمو البشرة تكملة وسط النمو. ثم ، انقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من لوحة البئر 12 الموسومة.
شطف الأنبوب مع 500 ميكرولتر أخرى من عامل نمو البشرة تكملة وسط النمو وإضافته إلى البئر. صخرة لوحة البئر بعناية ثم ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون. ابدأ بالتحقق من التقاء الخلايا بنسبة 90٪ إلى 100٪.
بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط وإضافة ملليلتر واحد من HBSS البارد لغسل البئر. هز اللوحة بلطف وإزالة HBSS دون أي آثار متبقية. في وقت لاحق ، أضف 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على التربسين المسخن مسبقا لفصل الخلايا عن البئر.
صخرة بلطف وحضانة لمدة دقيقتين في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد نقل اللوحة من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، قم بشفط المحلول الذي يحتوي على التربسين أثناء الإمالة. قم بتفريقها بعناية وببطء فوق البئر عدة مرات حتى تنفصل الخلايا تماما.
بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية هذا إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر وضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي. تدور في 300 مرة غرام لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية وتعيد الأنابيب إلى خزانة السلامة الحيوية. إزالة supernatant دون لمس الكرية.
الآن أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من وسط النمو المسخن مسبقا والسحب لأعلى ولأسفل حوالي 30 إلى 40 مرة. أخيرا ، بذور 100 ميكرولتر من تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه في وسط ست زلات غطاء مغلفة من لوحة البئر 24. ضع الصفيحة على الحاضنة واترك الخلايا تستقر على النقل اللاحق باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير الذي يقلد.
يوضح الشكل ظروف التحكم بعد خمسة أيام من النقل مع وجود عدد قليل من الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato. بعد علاج miR-25 ، تم العثور على العديد من الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato. وكشف القياس الكمي عن زيادة أربعة أضعاف في عدد الخلايا الإيجابية للطماطم Ascl1-Tomato في الآبار المعالجة miR-25 مقارنة بالضوابط.
الأهم من ذلك ، أن الغالبية العظمى من الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato الموجودة في الآبار المعالجة riR-25 تبنت مورفولوجيا عصبية. وشملت ملامح هذا التشكل العصبي انخفاض حجم سوما الخلية، وتطوير العمليات الدقيقة وتشكيل شبكات صغيرة. كشف القياس الكمي أن حوالي 70٪ من جميع الخلايا الإيجابية ل Ascl1-Tomato لها ميزات عصبية.
يظهر وضع العلامات المناعية الفلورية أن الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato ذات المورفولوجيا العصبية تعبر عن العلامات العصبية OTX2 و MAP2 ، مما يؤكد الهوية العصبية. كشف القياس الكمي لهذه الخلايا أنه بعد الإفراط في التعبير عن miR-25 ، يوجد حوالي 40 خلية عصبية إيجابية Ascl1-Tomato لكل حقل مقارنة بخمس خلايا عصبية لكل حقل في الضوابط. تشكل الخلايا العصبية المحددة حوالي 70٪ من إجمالي عدد الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato للعينات المعالجة miR-25.
علاوة على ذلك ، أظهر التقدير الكمي للعدد المطلق للخلايا العصبية المشتركة OTX2 و MAP2 أنه بعد علاج miR-25 ، تم العثور على حوالي 60 خلية عصبية لكل حقل مقارنة ب 10 خلايا عصبية لكل مجال في الضوابط. من الضروري العمل في بيئة نظيفة ومعقمة بأدوات نظيفة ومعقمة والعمل بعناية من خلال تجنب أي معاملة قاسية. يمكن أن تكون التطبيقات النهائية على سبيل المثال ، تحديد كمية البروتين ، أو تحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، أو الدراسات الكهروفسيولوجية.
ساعدتنا هذه التقنية على استكشاف الأسئلة الأولية حول إعادة البرمجة النووية التي تنتمي إلى مجال الطب التجديدي. وهناك مجموعة طويلة من العوامل والظروف التي يمكن اختبارها من أجل استكشاف أسئلة جديدة.
