この実験方法は、エピゲノム試験のために再利用可能な単一細胞の長期保存を可能にする。また、同じ単一細胞内の多くのエピジェネティックマークと転写因子の分析も可能です。現在のシングルセルエピゲノム解析法では、同じシングルセルを再解析することはできません。
しかし、再利用可能な単一細胞では、同じ単一細胞を何度も再解析することができます。この技術は、特に患者の細胞数が限られている場合に、エピジェネティック治療の診断と設計に役立ちます。この方法は、エピジェネティックマークに対する特異的抗体が利用可能である限り、エピゲノム、遺伝子発現の制御、およびその他のシステムの研究に最も適しています。
この手法を初めて試すときは、あまり貴重ではないサンプルで練習し、MiSeq や iSeq 100 などの浅いシーケンスを使用して実験を検証することをお勧めします。まず、クリーンな層流フード内で、1ミリリットルの細胞懸濁液と、DNA用のインターカレーター色素を含む1ミリモルのEDTA PBS199ミリリットルを混合します。混合後、200マイクロリットルの細胞懸濁液を平底96ウェルプレートの各ウェルに移す。
カバーを96ウェルプレートに置き、走査型顕微鏡を使用してプレートをスキャンします。次に、プレートを傾け、単一セルがウェルの下端に沈むまで数分待ちます。次に、ピペットチップを下隅に置き、シングルセルとバッファーをPCRチューブに移します。
蛍光顕微鏡を用いてウェルを確認し、転写を確認する。単一の細胞がまだウェル内にある場合は、DNA用のインターカレーター色素を含む1ミリモルのEDTA PBSをウェルあたり200マイクロリットル添加し、転写を繰り返します。移管後、96ウェルPCRプレートにカバーを置き、スイングローターを使用してプレートを中断なく遠心分離します。
遠心分離後、自動リキッドハンドリングロボットのデッキにプレートを置きます。次に、補足コード1を液体処理ロボットのソフトウェアウィンドウにドラッグアンドドロップし、プログラムを実行して、非常に遅いピペッティング速度で195マイクロリットルの上清を除去します。50マイクロリットルの4%TEMEDまたは鉱物油を加え、プレートを室温で一晩インキュベートします。
翌日、ピペッティングで鉱油を取り除き、200マイクロリットルのTPマグネシウム陰性緩衝液で細胞を5回洗浄します。最後の洗浄後、上清を除去し、15マイクロリットルのアニーリングバッファーを加え、氷上で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PCRチューブをサーマルサイクラーに置き、摂氏94度で3分間加熱します。
次に、チューブを氷冷した金属ブロックに移し、2分間インキュベートします。次に、4マイクロリットルの硫酸マグネシウム - 塩化ナトリウムを加え、DNTPを混合し、最高速度でボルテックスして混合する。次に、1マイクロリットルのBSTポリメラーゼラージフラグメントを加え、ボルテックスで混合し、シェーカーで4時間インキュベートします。
インキュベーション後、PCRチューブをサーマルサイクラーに置き、本文に記載されているように4時間または一晩のプログラムを実行します。抗体結合のために、1.625マイクロリットルの塩化ナトリウムEDTA BSA溶液をチューブに加える。低速でボルテックスして混合し、チューブを氷上で1時間インキュベートします。
次に、抗体1ミリリットルあたり0.1マイクログラムを加え、抗体プローブと結合させたコントロールIgGを加えます。抗体を添加した後、穏やかに振とうしながら氷上でチューブをインキュベートします。翌日、氷上で200マイクロリットルのTPM-Tバッファーで細胞を2回洗浄します。
その後、上清を除去し、T4 DNAリガーゼバッファーで1回洗浄する。次に、19マイクロリットルのライゲーションアダプター溶液を加え、摂氏25度で1時間インキュベートします。次に、1マイクロリットルのT4 DNAリガーゼを添加し、中速でボルテックスしてチューブを混合します。
チューブをサーマルサイクラーに置き、近接結紮プログラムを実行します。実行後、200マイクロリットルのBSTマグネシウム陰性EDTA陽性バッファーで細胞を2回洗浄し、摂氏4度で一晩保存します。翌日、200マイクロリットルのBSTマグネシウム陰性EDTA陰性バッファーで細胞を2回洗浄し、BST、DNTP、および硫酸マグネシウムを含む混合物20マイクロリットルを加えます。
次に、ボルテックスミキサーで混合し、オービタルシェーカーでチューブを4時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブをサーマルサイクラーに置き、テキスト原稿に記載されているように完全な拡張プログラムを実行します。次に、多重置換増幅のために、0.4マイクロリットルの100マイクロモル第2ランダムプライマーを添加し、ボルテックスにより混合する。
次に、チューブをオービタルシェーカーで2時間インキュベートしてから、チューブをサーマルサイクラーに乗せて摂氏94度に加熱します。3分後、チューブを氷冷した金属ブロックに入れ、1マイクロリットルのBST DNAポリメラーゼを加えます。チューブを低速でボルテックスします。
次に、チューブをサーマルサイクラーに配置して、多重変位増幅プログラムを実行します。プログラム終了後、約20マイクロリットルの上清をPCRチューブに移し、マイナス80°Cで保存します。次に、再利用可能な単一細胞を含むPCRチューブに20マイクロリットルの0.05%TWEEN 20および0.1X TEバッファーを加え、チューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、上清を採取し、先に採取した上清と合わせる。次に、50%グリセロール、5ミリモルEDTA、0.5%BSA、および0.05%TWEEN 20を含む再利用可能なシングルセルおよびTBSバッファーを浸し、オービタルシェーカーで30分間インキュベートします。インキュベーション後、再利用可能な単一細胞をさらに使用するまで摂氏マイナス20度で保管します。
最後に、40マイクロリットルのExoネガティブマスターミックスを追加し、チューブをサーマルサイクラーに置いて、テキスト原稿に記載されているようにプログラムを実行します。K562再利用可能な単一細胞を、このプロトコルを用いて生成した。単一細胞をポリアクリルアミドビーズの外層に包埋し、DNA染色用のインターカレーター色素を用いて可視化した。
BciVI消化前後のDNA産物をここに示します。制限酵素消化により、予想される19〜20、31〜32、49、および49を超える塩基対フラグメントが生成されました。また、構築したDNAライブラリーを、目的物についてキャピラリー電気泳動により解析した。
シーケンシングの結果は、抗ヒストンH3アセチル化リジン27および抗ヒストンH3トリメチル化リジン27からのユニークなマッピングリードが対照IgGからのものよりも有意に多いことを示しました。REpiシーケンシングシグナルは、REpiシーケンシングデータとバルクChIPシーケンシングデータを比較することによって評価した。平均して、REpiシーケンシングからのヒストンH3アセチル化リジン27シグナルの約91%が、バルクChIPシーケンシングにおけるヒストンH-3アセチル化リジン27ピークと重複した。
不活性ヒストンマークであるヒストンH3トリメチル化リジン27のREpiシーケンシングの精度は52%でしたREpiシーケンシングの感度を分析して、REpiシーケンシング再生リードによってバルクChIPシーケンシングのピークがいくつ検出されたかを測定しました。REpiシーケンシングの感度は、ヒストンH3アセチル化リジン27で55.30%、ヒストンH3トリメチル化リジン27で50.94%でした。必ずDNSフリーの試薬を使用してください。
また、チューブリードまたは試薬リードを開くことを含むすべての操作は、清潔なフード内で実行する必要があります。この手順のDNA産物は配列決定され、次にゲノムにマッピングされ、単一細胞のゲノムのどの領域にどのヒストン修飾が存在するかを明らかにします。この技術により、同一細胞内の複数のエピジェネティックマークの解析が可能になり、任意の単一細胞におけるマルチオミクス解析への道が開かれました。
