このプロトコルは、代謝産物および寄生虫分布の3Dモデルを構築するために使用することができる。これは、局所組織代謝摂動、寄生虫分布、および臨床疾患症状との関係を理解するのに役立ちます。この方法の主な利点は、代謝産物分布対病原体分布のライブスケール臓器間マッピングとその統計分析を可能にすることです。
理論的には、化学地図作成は、病因および治療の効果に関与する代謝産物を直接調べることによって、疾患の発症および宿主への影響を探求することができる。チューブの重量を量り、ラベルを付けることから始めます。チューブごとに1つのセクションで組織を体系的に切断する。
組織サンプルを含むチューブを計量してサンプル重量を決定し、重量を記録します。組織サンプルの水ベースの均質化を行うには、組織サンプルを含む2ミリリットルの微量遠心管に1つの5ミリメートルのステンレス鋼ビーズを加える。LCMSグレードの水を入れたブランクチューブを1本作ります。
冷却したLCMSグレードの水を加えて、サンプルの50ミリグラムあたり500マイクロリットルまでの容量を作り、25ヘルツで3分間サンプルを均質化します。サンプルは完全に均質化する必要があります。ホモジナイズ量の1/10をDNA抽出やその他の分析のために収集します。
4マイクロモルのスルファクロロピリダジンでスパイクした氷冷LCMSグレードのメタノールをホモジネートに加える。サンプルを組織ホモジナイザーで25ヘルツで3分間ホモジナイズし、続いて10分間遠心分離を行った。等量の上清を96ウェルプレートに集め、上清を回収しながら固体残渣を氷上に保持する。
水性抽出上清を最高速度および加熱なしで完全に乾燥させる。固体残渣サンプルの50ミリグラム当たり2マイクロモルのスルファクロロピリダジンでスパイクしたメタノールに1,000マイクロリットルの予め冷却されたジクロロメタンを加えることによって有機抽出を行う。サンプルを25ヘルツで5分間ホモジナイズし、続いて10分間遠心分離を行った。
等量の上清を96ウェルプレートに集める。目的の臓器の写真を撮ります。[ファイル] をクリックし、SketchUp ソフトウェアで [インポート] をクリックして、目的の臓器の画像をインポートします。
線ツールをクリックし、フリーハンドオプションを選択します。鉛筆ツールを使用して、目的の臓器の輪郭をトレースして描画します。プッシュ/プルツールを選択し、シェーディングされた領域をプルアップして、図面を2Dから3Dに変換します。
ファイルをdae形式でエクスポートするには、[ファイルのエクスポート]をクリックし、[3Dモデル]をクリックします。モデルのリアリズムを向上させるには、[ファイル] を選択し、[メッシュのインポート] をクリックして、モデルを MeshLab ソフトウェアにインポートします。トップメニューの「ワイヤフレーム」(Wireframe) を選択し、「フィルタ」(Remeshing Simplification and Reconstruct) をクリックしてから、「サブディビジョンサーフェス中点」(SubDivision Surfaces Midpoint) をクリックします。
すべての値をデフォルトのままにし、[適用] を 2 回選択します。モデルをSDL形式でエクスポートするには、[ファイル]、[メッシュのエクスポート方法]の順にクリックし、[ファイルの種類]ドロップダウンメニューで[SDLファイル形式]を選択します。これを保存し、次のポップアップメニューで「OK」を選択します。
メッシュミキサーソフトウェアを開き、前の手順で生成されたSDLファイルをインポートします。スカルプト、ブラシ、ドラゴンスカルプト、ブラシ、インフレーションツールを使用して、丸みを帯びる必要があるモデル表面を引き出します。モデルが目的の外観になったら、[ファイルとエクスポート]をクリックしてSDL形式で保存します。
必要に応じてファイルに名前を付け、SDLバイナリ形式を選択して保存します。MeshLab ソフトウェアで 3D モデルを開きます。ポストオープン処理ポップアップウィンドウで[OK]をクリックします。
各サンプリング スポットの X、Y、Z 座標を取得するには、ポイント選択ツールを選択し、3D モデル サーフェス全体で等間隔で右クリックします。必要な座標がすべて選択されたら、フォームポップアップウィンドウの一番上の[保存]ボタンをクリックします。表計算ソフトで、前の手順で作成したppファイルを開きます。
データ表示を調整するには、[列へのデータテキスト]をクリックし、[区切り]をクリックします。[次へ]をクリックし、[スペース]を選択して[完了]をクリックします。スプレッドシートのセルに数値のみが残るように再書式を設定するには、「ホーム検索」と「置換」を選択します。
[検索対象] ボックスに「Y 等しいコート」と入力し、置換ボックスを空のままにします。[すべて置換]をクリックし、[OK]をクリックします。X 等しいコート、Z 等しいコート、および より大きいコートスラッシュについて繰り返します。表計算ソフトウェアのテーブルでは、行は各位置に対応し、列はデータに対応します。
適切なメタデータと代謝産物の特徴の豊富さをスプレッドシートの後続の列に貼り付けます。半径列に、モデル上で視覚化するサンプリングスポットの希望サイズを入力します。半径の値を経験的に決定し、CSV形式でファイルを保存します。
ELIプロットソフトウェアに移動し、[サーフェス]を選択してから、作成した3Dモデルをブラウザウィンドウにドラッグアンドドロップします。作成したフィーチャーテーブルを同じブラウザウィンドウにドラッグアンドドロップします。右下隅の凡例を使用して、目的のデータ列を 3D モデルに投影します。
各データ列を連続して選択して、3D モデル上のこの代謝産物フィーチャの分布を評価します。この分析により、5, 502 個のフィーチャとその 3D での視覚化の表が作成されました。このアプローチにより、寄生虫負荷の高い部位で高い個々の動物の代謝産物の特徴、組織領域間で差異分布を持つ代謝産物、および小腸と大腸で同等のレベルで見られる代謝産物の特徴を視覚化することができます。
LCMS溶媒のみを使用し、隣接するすべての組織を収集し、収集されたすべてのサンプルの代謝産物を抽出して、空間マップのギャップを回避することを忘れないでください。この技術は、トリパノソマチド型寄生虫による組織コロニー形成のための栄養所要量を探索し、感染時の3D代謝産物分布マップを比較することによって疾患の病因を理解するために使用することができる。
