シャーガス病のトリパノソーマ・クルジ剤は、臨床的に認められた病理に侵入する可能性のある長期的な症候性感染症を生み出す可能性がある。シャーガス病で死亡した少年の半生管内のトリパノソーマ・クルジの巣の発見は、シャーガス寄生虫の性的伝染の可能性を解明するための研究プロトコルを示唆している。5年間の医療を提供し、急性シャーガス病の臨床症状を有する参加者を示す家族を募集します, ACG.
1年離れた3回に家族参加者の静脈血の15mlを得て、3、5ミルのアリコートに分け、4つの摂氏で貯蔵する。成人のボランティアから集められた2mlの血清射精は、分子アッセイを検証するためにACG症例の血液中のT.cruziを示す。ACG血液アリコートからT.cruziを分離し、抗凝固剤を用いて滅菌10mlチューブに貯蔵される。
5mlの血液を50mlのチューブスラントに5ml加え、5mlの肝臓注入トリプトーゼ培地に接種し、27°Cのシェーカーで3ヶ月間インキュベートする。ガラススライド上の上清の100マイクロリットルでT.cruziの顕微鏡を検索します。1,000 x Gで1000xGで遠心した培地からフラメレートを収穫し、PBS pH 7.4で洗浄した。
75mlのL6筋細胞培養フラスコをそれぞれ10〜6番目のT.cruzi分離株で接種する。37センチグレードでダルベッコミニマルエッセンシャル培地、DMEMの15 mlで培養細胞を供給します。寄生虫分離株を成長させ、肯定的なコントロールベレニスT.cruzi.
T.cruzi相対リーシュマニアブラジルを否定的なコントロールとしてDMEMで成長させる。マウスに感染するためにT.cruzi trypomastigotes由来の第6の組織培養に10 x 10を使用する。1ヶ月後に再生の筋肉や器官のセクションでT.cruziの巣を検索します。
EDTAコーニング滅菌10mlチューブ内の血液アリコートを使用し、45分間3,000 x Gで密度勾配遠心分離によって白い細胞を採取する。細胞をPBSと遠心分離機で1,500 x Gで2回洗浄し、別のチューブで10分間洗浄します。109人の家族被験者からL.braziliensisからベレニスT.cruziから送られた分離株からDNAを抽出し、プロトコルのステップ3.3のように21人の参加者から精子からDNAを抽出する。
0.8%アガロースゲルでDNA濃度を測定し、206ナノメートルで吸収します。T.cruzi TCZ 1ダッシュ2プライマーをPCR分析で188ヌクレオチドプローブにアニールして使用します。PCRミックスを10ナノグラムテンプレートDNA、プライマーの各ペアの0.4マイクロモル、2単位ストックDNAポリメラーゼ、0.2マイクロモルDNA-TP、および5マイクロモルモル塩化マグネシウムを25マイクロリットルの最終体積で混合します。
ステップ3.5.2のようにDNA増幅を行い、ゲル中のDNAバンドを示す。T.cruzi 188ヌクレオチドプローブアニールを使用して、アルファ32P dATPでプライマーラベルを使用し、PCR産物を1.3%アガロースゲルで分離し、正に帯電したナイロン膜に転写します。膜を洗浄し、可変期間のX線場に露出するようになりました。
X線分野から選択したクローンを成長させ、TCZ1ダッシュ2プライマーで商業的に配列します。3つの独立した免疫蛍光アッセイを実施し、109人の研究参加者からPBSで1〜100の血清希釈を三重化する。遠心分離機は、30分間1,000 x Gで封入血液の5mlアリコートを遠心し、血清をマイナス20°Cで保存する。
1年離れて3回の試験サンプルから独立した免疫蛍光血清希釈液を実行します。正式にインキュベートされたT.cruzi amastigotesまたはL.braziliensisのプロマスティゴトの5マイクロリットルを使用し、PBS懸濁液中のマイクロリットルあたり10個の寄生虫をガラススライドに使用し、ステップ5.3.3のように一晩乾燥させます。100マイクロリットルの100マイクロリットルの血清希釈液でガラスの寄生虫をインキュベートし、37°Cで1時間湿ったチャンバーでスリップで覆い、PBSで2回洗浄します。
空気乾燥ガラススライドをヒトIgGに対して1~1,000本のフルオレセイン標識ウサギ抗体の希釈液でインキュベートし、洗浄して乾燥させます。カバースリップでガラススライドを取り付け、UV光顕微鏡で検査します。T.cruziおよびL.braziliensis可溶性抗原を100マイクロリットルの炭酸塩バッファーpH 9.6の1マイクログラムで検出する。
1~100マイクロリットルの100マイクロリットルを4分の1のウェルに三分の1にインキュベートします。PBS-トゥイーン溶液でプレートを2回洗い、乾燥するのを待ちます。100マイクロリットルのアルカリホスファターゼコンジュゲートの100マイクロリットルをインキュベートし、ヤギ抗ウサギIgG。
PBS-Tweenでプレートを2回洗浄し、基質パラニトロフェニルホスポーテを加え、色の発達を待ちます。マルチモードプレートリーダーで630ナノメートルの光学密度を読み取ります。肥沃な鶏の卵をトランスライトし、その泡でシェルに穴を開けます。
モックコントロール卵中の各殻培養培地に100個のトリポマスチゴを接種する。粘着テープで穴を密封します。37摂氏、湿度65%で21日間、卵をインキュベートします。
モックコントロール、グループB、T.cruzi接種卵から、グループCから大人の生活まで、ライブコントロールエッググループAから孵化した雛を成長させます。グループBとCの鶏に10 x 10で2回挑戦し、7番目の正式にインキュベートされたトリポマスティゴテを毎週行います。チャレンジの5週間後にA、B、C鶏の翼静脈から静脈血の2mlを得る。
血清を分離し、免疫蛍光分析装置を実行してT.cruzi抗体を検出します。優れた住宅、食料、水供給で安全な動物福祉。精液を成人から射精し、APCR陽性シャーガス病の症例、およびプロトコルのステップ1.5のように対照対象から使用する。
100マイクロリットルの精液を腹膜に、そしてマウスの膣に植え付ける。親マウスおよび子孫マウスにおけるT.cruzi感染の性感染。急性シャーガス病由来のトリパノソーマ・クルジの足跡は、無線標識プローブと事前に形成されるnDNA-PCR産物によって示された。
T.cruziの表現型は、免疫蛍光アッセイで明らかにした。抗T.クルジ抗体は、L.ブラジル人症を認識しません。
ELISAおよびnDNA-PCRアッセイのグラフィック表現。グループ1と2、負と正のコントロールをそれぞれ。グループ3、陽性nDNA-PCRおよび特異的抗体アッセイ。
NDNA-PCRによって検出されたT.cruzi感染を有するグループ4は、特定の抗体がない場合である。グループ5、感染フリー参加者。家族集団の異端とマッピングは、抗Tの比率の間に不一致を示した。
クルジ抗体およびnDNA-PCRアッセイのそれら。オープンは正方形と円、負の男性と女性です。抗Tと赤.
クルジ抗体およびnDNA-PCR陽性。黒、陽性のnDNA-PCRのみ。鶏の免疫寛容は、T.cruzi接種卵から孵化した。
A、模擬対照、B、T.cruzi抗原に挑戦した生きた制御された鶏。C、ニワトリは、特定の抗原で挑戦した後にT.cruzi接種卵から孵化した。T.cruziの感染性は、精液が腹腔と膣に浸透したときに示された。
これらの静止画の3週間を犠牲にしたマウスは、心臓、骨格筋、および血管内および子宮管のアマスティゴテ巣を示した。マウスモデルシステムにおけるT.cruzi感染の性感染。T.cruziは男性と女性に感染し、感染をナイーブな仲間に伝染させた。
T.cruzi感染は親マウスから子孫マウスに垂直に移った。サザンブロッティングは、F1ごみの大半で寄生虫アンジネートバンドを明らかにした。免疫性ペルオキシダーゼ染色T.cruzi amastigotesは、エピジドマイティスの間質および前生マウスの半生管の内腔に、エンゴニアブラストを示した。
シャーガス病の21の急性症例における原虫の寄生虫学的実証は、すべての感染対象者におけるT.cruziフットプリントを検証するために極めて重要であった。寄生虫抗体アッセイの比率と核酸検査の比率の間の不一致は、抗体フリー患者の足跡の大部分を明らかにした。大きな違いは、胚発生の最初の週の後にT.cruziに反映された鶏モデルでよく説明しています。
免疫寛容な成人鶏は寄生虫の足跡を示したが、特定の抗体は存在しない。シャーガス患者の重要な抗クルジは、マウス膣に浸透し、腹腔に浸透すると広範囲にわたる感染症を開始した。病理は、心臓および骨格筋および精管のT.cruzi amastigote巣と子宮管を示した。
ナイーブな仲間を持つシャーガスマウスの繁殖は、感染した雌と雄がT.cruziを感染していないナイーブな仲間に伝染させ、その大部分のごみが感染を垂直に子孫に移したことを明らかにした。家族ベースのプロトコルは、信頼性の高い輸血と疫学の問い合わせを行い、進行中の性感染症の可能性を解明するために核酸アッセイに対処しました。
