この議定書と彼の貴重な指導の基礎を築いてくれたウェスリー・ワン博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(グランツR01GM127575およびR01GM121584)およびウェルチ財団(グラントA-1715)によって部分的に支援されました。

1. プラスミド建設
<ol><li>まず、ヒストンタンパク質がアセチル化され、どのリジン部位でアセチル化されるか決定します。サイト指向変異誘発を用いて、サイトをアンバーストップコドン(TAG)に変異させる。 注:ヒストンタンパク質の発現に利用される4つの以前に設計されたプラスミドがあります。4つのヒストンタンパク質はすべて、N末端ヒスチジンタグを用いてpETDuet-1ベクターにクローン化された。ヒストンH4はまた、SUMOタグ、約40のコピー数を有する複製 colE1 の起源、アンピシリン耐性、およびT7プロモーターを含む。<ol>
<li>4つのヒストンタンパク質プラスミドの1つで、目的の部位にTAG突然変異を含む前方および逆プライマー(既存のリジンコドンをアンバーストップコドンに置き換える)を設計します。</li>
		<li>プラスミドを含むタグを増幅するために、全プラスミドPCRを使用してください。プライマーに適したアニーリング温度を決定します。一般に、プライマーから5°Cを引いた融解温度(Tm)で十分です。PCR産物の入手が困難な場合、T m~5°C付近の温度勾配を使用して、アニーリング温度を最適化して増幅することができます。 注:この実験では、30 sの94°C(変性)、30秒のアニーリング温度、6分間(またはキロベースペアあたり1分)の72°Cの条件で、30サイクルに対して、社内で表現されたPFUポリメラーゼを使用しました。このタイプの PCR 方法の詳細については、劉とネイスミス7を参照してください。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 製品をクリーンアップします。アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色によりPCR産物を分析します。</li>
		<li>プラスミドを16°Cで一晩T4リガーゼでインキュベートしてリゲートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>まず、プラスミド(AmpR)を含むTAGを化学的に有能な 大腸菌に変換します。変換から最低4コロニーを選び、プラスミドを浄化します。標準的な方法を使用してグリセロールでそれぞれの細胞ストックを作り、-80°Cで保存します。 必要な TAG 変異を確認するために、シーケンス処理のために送信します。</li>
	<li>配列が確認されたら、TAG含有プラスミド(AmpR)をpEVOL-AckRS(ChlR)と共に化学的に有能なCobB( 大腸菌で知られている唯一のヒストンリシンデアセチラーゼ)をヒートショック法を用いてBL21細胞を欠失させる。pEVOL は、コピー番号が低いコピー番号 p15A 原点に中間コピー番号を持つプラスミドです。 注:プラスミドのpEVOLシリーズは、直交aaaRS/tRNATyr ペアの発現増加を示す以前の研究に基づいて構築され、タンパク質の切り捨てを減少させ、変異タンパク質の全体的な収量を増加させる効果があった8。CobB欠失細胞がアクセスできない場合は、化学的に有能なBL21細胞を使用して進みます。CobBは、サーチュイン様ヒストンリシンデアセチラーゼおよびニコチンアミドをヒストンタンパク質発現中に5mMの最終濃度で添加して、代替アプローチ9としてCobBを阻害することができる。</li>
	<li>セルストックを作り、-80°Cで保管してください。</li>
</ol>2. アセチル化ヒストンタンパク質発現
<ol><li>1 Lのオートクレーブ2YT培地(または選択量)を培養フラスコに調製する。</li>
	<li>2YT培地の20mLを、TAG含有プラスミド(AmpR)およびpEVOL-AckRS(ChlR)を有する共形細胞ストックと共形化した細胞ストックを含む20mLを接種し、37°CでOD=0.6(4-6h)に成長する。</li>
	<li>1 Lのオートクレーブ2YT培地に適切な抗生物質を加え、20 mLスターター培養液で接種します。37°CでOD = 0.6-0.8(2-3 h)に成長します。</li>
	<li>誘導剤およびアセチルリシン(AcK)をIPTG 1 mM、0.2%アラビノース、およびAcK 5 mMの最終濃度に加えます。</li>
	<li>37°Cで6〜8時間培養します。</li>
	<li>ペレット細胞は2,700 x g で15分間用いた。</li>
	<li>細胞ペレットを-80 °Cで一晩保管してください。</li>
	<li>このステップ以降は、常に氷の上にサンプルを保ちます。培養液1L当たりヒストン溶解バッファーの50mLに細胞ペレットを溶解する。</li>
	<li>次のサイクルに従ってソニッケート:1 sオン、1 sオフ、時間通りに合計:60%振幅で3分。</li>
	<li>41,600 x g で45分間ペレット包包体。</li>
	<li>上清を捨て、ヒストンリシスバッファーの30 mLで封入体を再中断します。ペレットインクルージョンは41,600 x g で30分間です。</li>
	<li>上清を捨て、30 mLのペレット洗浄バッファーに封入体を再中断します。ペレット包包体は41,600 x g で30分間です。</li>
	<li>上清を捨て、含包体を6Mグアニジン塩酸塩(GuHCl)緩衝液の25 mLに溶解する。37°Cで1時間撹拌してインキュベートする。 注:必要に応じて、封入体は4°Cで一晩攪拌してインキュベーションすることができます。</li>
	<li>ペレットインクルージョンは41,600 x g で45分間です。上清を1 mLのNi-NTA樹脂で2時間6M GuHClバッファーと平衡化してインキュベートします。</li>
	<li>変性条件下でのNi-NTAの精製を進めます。カラム洗浄バッファーの3桁のボリュームでカラムを洗浄します。溶出緩衝液の10 mLでヒストンタンパク質をアセチル化した。 注:ここでタンパク質を濃縮しようとすることはオプションですが、アセチル化ヒストンは非常に予測不可能であり、容易に沈殿することができます。2mLを超えて総量に集中することはお勧めできません。</li>
	<li>アセチル化ヒストンタンパク質を5%の酢酸緩衝液に対して広範囲に透析し、塩を除去する。4°Cで一度に3時間の透析液を、最低6回の新鮮な緩衝液と交換する。 注:タンパク質の純度を向上させるために、純水に対して透析するオプションがあります。しかし、これは、低収量のアセチル化ヒストンタンパク質にとって望ましくない可能性がある有意な沈殿および収量の低下を引き起こす。</li>
	<li>アリコートと凍結乾燥タンパク質を、-80°Cで無期限に保存する。 野生型ヒストンタンパク質は一般に10〜50mg/Lを生成し、アセチル化ヒストンタンパク質は特定のリジン部位に応じて10mg/L未満の収量を示します。例えば、H3K79Acは5mg/Lの平均値を示す。</li>
</ol>3. 野生型ヒストンタンパク質発現
<ol><li>完全なヌクレオソームを組み立てるには、4つのヒストンタンパク質すべてを発現する。野生型ヒストンを表現して浄化する場合、プロトコルは以下を除いてアセチル化されたヒストンと同じです。<ol>
<li>共変換を実行しないでください。野生型ヒストン表現には pEVOL-AcKRS を使用しないでください。それに応じて抗生物質を調整します。</li>
		<li>細胞の発現の誘導時に、CobB欠失細胞株を使用したり、ニコチンアミド、AcK、またはアラビノースを添加したりしないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 601DNAの作成
注:以前に設計された最適化されたDNA配列は、ヒストンオクターで組み立てられ、高効率で単核組を生成します。この配列は、601 DNAまたはWidom配列と呼ばれる。この配列は、クロマチンリモデリングアッセイから単一分子測定10までのヌクレオソームのインビトロ研究のための標準的なDNA配列となっている。
<ol><li>ヌクレオソームアセンブリ用に601 DNAのかなりの量を調製するには、pGEM-3z/601をトップ10細胞に変換し、プラスミド増幅および抽出のために10 mLの培養を増殖させます。プラスミド抽出キットを使用し、メーカーの推奨に従ってください。</li>
	<li>この増幅プロトコルには、社内で表現されたPFUポリメラーゼ(より効率的)を使用してください。PCR反応を設定する:250 μL反応の場合、207.5 μL オートクレーブMQ H2O、25 μL 10x PFUバッファー、5 μLフォワードプライマー:ctggagaatcccgggcgccg、5 μL リバースプライマー:アサガタタタタトガカック、5 μLNTPミックス、2.5μL PFU酵素を使用します。私たちは通常、組み立てるのに十分なDNAを得るために一度に60の反応を実行します。</li>
	<li>PFUポリメラーゼを使用する場合は、30 sで52°Cのアニーリング温度と延長時間30sを使用してください。それ以外の場合は、メーカーの推奨条件に従ってください。</li>
	<li>PCR が完了したら、PCR 製品を精製するために、選択した PCR クリーンアップ キットを使用します。</li>
</ol>5. ヒストン・オクターマーの組み立て
<ol><li>ヒストンタンパク質ペレットH2A、H2B、H3、およびH4のアリコートを溶解し、総体積100μLのGuHClバッファ内にヒストンタンパク質のそれぞれ別々のストックが存在するようにします。</li>
	<li>A280吸光度を測定して、ヒストンタンパク質の濃度を計算します。</li>
	<li>吸光度がタンパク質に対して1より大きい場合は、より正確な濃度を得るためにGuHClバッファーで希釈する。</li>
	<li>H2AとH2Bのタンパク質を1:1モル比で組み合わせ、合計4μg/μLのタンパク質濃度に希釈します。</li>
	<li>2 M TE バッファーに対して 4 °C で連続して 2 M TE バッファー 2 時間、0.5 M TE バッファー 5 時間。 注:透析の第2および第3のステップは、タンパク質の不安定な立体構造を引き起こし、沈殿します。これらのステップでは大きな降水量が予想されます。</li>
	<li>4°Cで16,800 x g で遠心分離により沈殿物を除去する。</li>
	<li>再度、A280 吸光度を測定するヒストンダイマー(H2A/H2B混合物)と四量体(H3/H4混合物)の濃度を計算する。</li>
	<li>1:1モル比でダイマーと四量体を混合し、固体NaClを加えてNaClを2Mに調整します。</li>
	<li>ヒストン・オクターマーは4°Cで保存でき、ダイマーやテトラマーよりも安定しています。これは分解を引き起こす可能性がありますので、ヒストンオクタマーを凍結しないでください。</li>
	<li>アセチル化ヒストンで組み立てる場合は、野生型タンパク質を手順中のアセチル化タンパク質に置き換えるだけです。</li>
</ol>6. 核組立体
<ol><li>100x TE バッファーと固体 NaCl を使用して、601 DNA を 2M TE バッファーに調整します。2M TE バッファーの 601 DNA をヒストンオクタマーに 0.85:1 ~ 0.90:1 のモル比で加えます。遊離DNAがゲルシフト解析に存在する場合、DNAの比率が低くなる可能性があります。</li>
	<li>DNA-ヒストン混合物を透析袋に移し、2M TEバッファーの約200 mL(または複数のサンプルを組み立てる場合は複数)に入れ、4°Cで非常に穏やかにかき混ぜます。</li>
	<li>塩TEバッファーをゆっくりと滴下するためにパージする蠕動ポンプを設定します。ボリュームがおよそ2倍になったら、半分のボリュームを注ぎます。これを合計で少なくとも4回実行します。ポンプを使用すると、開始体積に応じて4-8時間かかることがあります。ヌクレオソームは、塩濃度が150mM(塩分濃度計で測定)に減少すると形成される。</li>
	<li>塩濃度が150mMに低下した後、透析は一晩で20mMのTEバッファーに対して。</li>
	<li>遠心分離により沈殿物を除去し、プレートリーダーを用いてA260 読み取りによるヌクレオソームの濃度を測定する。</li>
	<li>His-TEVプロテアーゼ(TEV:ヌクレオソーム1:30、w:w)を加え、4°Cで一晩インキュベートしてヒスチジンタグをすべて除去します。ニNTA樹脂プルダウンにより、核組液からヒスチジンタグ不純物を除去します。</li>
	<li>ヌクレオソームを位置決めし、試料を均質化し、60°Cで1時間インキュベートする。 注: 特に不安定なアセチル化されたサイトでは、この手順は推奨されない場合があります。</li>
	<li>4 °Cで、短期間(数週間)のヌクレオソームを保管する。</li>
	<li>長期保存のために、透析用ヌクレオソームは貯蔵バッファーに対して、-80°Cで保存します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysyl-tRNA+synthetase:+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool.">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li><li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo.">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li><li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases.">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li><li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes.">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li><li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7.">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Gallego-Jara, J., &#201;cija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., C&#225;novas D&#237;az, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide.">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS.">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li><li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol.">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li><li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+DNA+sensing+pathways:+STING,+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses.">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li><li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGAS+produces+a+2'-5'-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING.">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+[G(2',5')pA(3',5')p]+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase.">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+PLPLRT/SD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1.">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li></ol>

著者の誰かによって宣言する競合する財政的利益はありません。

実験中にこのプロトコルを詳細に従うことは不可欠です。ヌクレオソームは非常に安定しておらず、多くの試行錯誤がこのプロトコルを決定することに入っています。粒子状物は容易に組み立てプロセスを妨げる可能性があるので、すべてのステップ(または観察されるたびに)で沈殿物を除去することが重要です。常にヒストンサンプルを氷の上に置いてください。ヌクレオソームが4°Cで長時間保存されている場合、自発的に分解することができます。実験で使用する前に2週間以上4°Cで保存されている場合は、ネイティブPAGEでサンプルを確認してください。これはまた、それらを分解する原因となる可能性がありますので、渦オクターやヌクレオソームを避けてください。ダイマー、テトラマー、または八重奏体の組み立てに問題が発生した場合、これは通常、タンパク質の質が悪いという指標です。タンパク質の品質を15%SDS-PAGEで確認してください。タンパク質の純度が低い場合の1つの選択肢は、純粋な水に対してタンパク質を透析することです。これは、重い沈殿を引き起こし、タンパク質の収量を大幅に減少させるが、より純粋なサンプルを生成します。ヒストンアセチル化部位の組み込みおよびヌクレオソーム安定性は大きく異なる。一般に、部位がN末端ドメインに近いほど、ヒストンタンパク質発現中の収率は低くなる。ヌクレオソーム安定性のため、アセチル化部位が核コアまたはDNA結合部位に近いほど、組み立てられたヌクレオソームは安定性が低い。安定性の問題が発生した場合、常に核組み合いのサンプルを氷の上に保つことが重要です。分解または沈殿を引き起こす可能性があるため、60°Cでのヌクレオソーム位置決め工程を省略する必要がある場合がある。アセチル化ヌクレオソームの主な制限は、その不安定性である。ヌクレオソーム沈殿を引き起こさずに、37°Cなどのより高い温度でアッセイをプリフォームすることができない場合があります。実験手順が許せば、4°Cでアセチル化ヌクレオソームの沈殿を防止するように行う。
このヌクレオソームの製造方法は、結合実験および構造決定のための修飾ヌクレオソームの製造に特に有用である。この方法は、より高い純度と既知のヌクレオソームDNA配列を有するヌクレオソームを生成し、より良い制御実験およびより高い解像度画像をもたらす交結合変数を排除する。ヌクレオソームサンプルが既知のDNA配列と同質であることが構造決定にとって非常に重要であり、そうでなければ高解像度の画像を得ることは不可能です。
この方法には、潜在的な用途が豊富にあります。具体的には、エピジェネティクスの分野で。改変タンパク質を得ることは非常に困難な場合があります。修飾タンパク質の入手は、あまり理解されていない多くのエピジェネティック経路における作家、読者、消しゴムの構造と機能を調査する上で極めて重要です。我々は以前、この技術を用いて、H3アセチル化部位K18、K36、K56でヌクレオソームDNAのアクセシビリティを調査し、各変異オクタマーを、Pst1消化部位を含む改変601DNA配列で組み立てることによって行った。この技術は、AcK. PylRS以外の NCAA を組み込むためにさらに変更することができ、他の NCAA のホストを組み込むために設計することができます。また、いくつかのアセチル化部位でのSIRT7のヒストン脱アシル化活性を調べるため、エシェリヒア大腸菌のアンバーコドンによるN ε-(7-アジドヘプタノイル)-L-リジン(AzHeK)を組み込み、SIRT7のヒストン脱アシル化活性を調べた。 このアプローチにより、SIRT7はH3K36の脱アシル化に向けて高い活性を有し、またH3K37を脱アシル化するために触媒的に活性であることを明らかにした。H3K36脱アシル化は、ヌクレオソーム依存性であることがさらに示され、天然クロマチン6におけるヌクレオソーム間のつなぎDNAを模倣するアシルヌクレオソーム基質に短い二本鎖DNAを付加することによって有意に増強することができる。
この方法は、さまざまなシナリオで有用であり得る変更のない野生型ヌクレオソームを生成するように変更することもできます。我々のグループは最近、第2のDNA結合部位11を介してヒストンH2A及びH2Bによって形成された負電荷を有する酸性パッチへの環状GMP-AMP合成酵素(cGAS)の緊密な結合を示すPingwei Li博士のグループと共同で構造を発表した。cGASは、サイクリックジヌクレオチドcGAMPの合成を触媒するdsDNAセンサであり、Sting-TBK1-IRF3シグナル伝達軸12、13、14、15、16を介してI型インターフェロンの誘導を媒介する。
完全に組み立てられたヌクレオソームを使用することの利点は、エピジェネティック関連タンパク質の活動または結合能力を調査するより良いモデルとして機能するヌクレオソームのネイティブ状態によく似ている。ヌクレオソーム基質でプローブすると結果が大幅に変化する、裸のDNAまたはヒストンペプチド基質に対する酵素活性が限定または完全に存在しない例が数多く存在する。上記の例と同様に、SIRT7の新しい脱アシル化部位は、未知であったであろう核組み基質を用いて発見された。これらのタイプのシステムを調査する際には、ネイティブ基板を使用することが重要です。この技術は、ピロリジン遺伝コード拡張技術によって組み込むことができるあらゆる修飾の読み取り、書き込み、および活性または結合能力を探査するために使用することができる。ピロリシル-tRNA合成酵素は、すでにネイティブに無差別であり、研究者の創造性を主な制限要因にする任意の数のシステムでこの技術を使用するための扉を既に開いている他の基質のホストのために設計されています。

我々は、PylRSおよびtRNAPylを利用して、部位特異的アセチル化ヒストンを有する再構成単核体を合成および組み立てる。PylRSは、翻訳後修飾(PTM)を用いてタンパク質を産生する遺伝コード拡張ツールとして非常に価値があることが証明されており、約200の異なるncAAを組み込むために遺伝的に進化してきました。PylRSは、アンバーストップコドンで組み込み、翻訳中に他のアミノ酸との競合を除去します。PylRSは、メタノジェニック古風で初めて発見され、その後、新しい反応性化学基をタンパク質1,2に組み込むために化学生物学に利用されている。
MmAcKRS1はメタノサルシナ・メイジ・ピルスから進化し、アセチル化タンパク質3、4、5、6の合成のために私たちの研究室で頻繁に使用されました。MmAcKRS1は、大腸菌での翻訳中に選択したmRNAの中で、黄色の突然変異部位でAcKを提供する。この技術は、以前にK4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、K56、K64、およびK79ヒストンH3リシン部位にAcKを組み込み、アセチル化単核体4、5、6にサーチュイン1、2、6、および7の活性を研究するために使用されてきた。ここでは、アセチル化ヒストンを発現し、アセチル化ヌクレオソームを再構成するこの方法を詳述する。

<table><tbody><tr><td>0.5 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>1 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>100x TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>20 mM TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>Acetyllysine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Column Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV protease</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histone Lysis Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td></td><td></td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Storage Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

アセチル化ヒストンタンパク質は、変異体をコードする大腸菌、N ε-アセチルリジン(AcK)特異的メタノサルシナマジピロリシンtRNA合成酵素(MmAcKRS1)およびその同系tRNA(tRNAPyl)を組み立てるために容易に発現することができる。MmAcKRS1 および tRNAPylは、大腸菌での翻訳中に選択した mRNA の中で、黄色の変異部位で AcK を送達します。この技術は、H3リジンサイトでAcKを組み込むために広く使用されています.ピロリシル-tRNA合成酵素(PylRS)は、部位特異的なタンパク質修飾または機能化のために他の非カノニカルアミノ酸(ncAAs)を組み込むために容易に進化させることができる。ここでは、MmAcKRS1システムを用いたAcKをヒストンH3に組み込み、アセチル化H3タンパク質を再構成された単核球体に統合する方法を詳述する。アセチル化再構成単核体は、生化学的および結合アッセイ、構造決定、およびよりに使用することができる。新しい相互作用の発見やエピジェネティクスの理解に関連する実験を設計するには、改変単核体を得ることが重要です。

ダイマー、テトラマー、および八重差は、12% SDS PAGEゲルを実行することによって評価できます (図 1および図 2)。ここでは、アセチル化四量体の一部が他のテトラマーよりも低い収率を持っていることがわかります(図1)。実際、コア領域に近いほど、収率は低く見られます。これは、アセチル化が四量体の組み立てに干渉するため、コア領域に近づく可能性が最も高いです。オクタマーを組み立てた後も同様の影響が認められる(図2)。601 DNA配列を有するオクターマーを組み立てた後、ヌクレオソームは、5%1x TBE Native PAGEゲルを用いて、臭化エチジウムによる染色を行い、それを用いて評価することができる(図3)。TEV消化前に、10k基底対マーク付近ではヌクレオソームバンドが観察される。TEV消化後、ヌクレオソームバンドははしごに対してシフトダウンする。熱測位の前に、観察されたヌクレオソームバンドは非常に広く、おそらくストリークになる(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62113/62113fig01.jpg"> 図1:ヒストンダイマーと四量体 代表12%のSDS PAGEゲルの野生型ヒストンダイマー(レーン2)及びH3アセチル化四量体(レーン3-9)を含む。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62113/62113fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62113/62113fig2v3.jpg"> 図2:ヒストン八重奏機 代表12%のH3アセチル化ヒストンオクターマー(レーン2-11)のSDS PAGEゲルを表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62113/62113fig2v3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62113/62113fig03.jpg"> 図3:タグ付きH3K64Acヌクレオソーム複合体を組み立てた。H3K64Acヌクレオソーム複合体(レーン2)の代表1x TBEネイティブPAGEゲルは、エチジウムブロマイドで視覚化された遊離601DNA(レーン4)と比較した。レーン3は、60°Cで1時間インキュベーションした後のH3K64Acヌクレオソームを示す。レーン3では全てのヌクレオソームが分解されたことが観察される。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62113/62113fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62113/62113fig04.jpg"> 図4:組み立てられたTEV消化型ヌクレオソーム複合体 代表1x TBEネイティブPAGEゲルは、野生型TEV消化ヌクレオソーム複合体、及び遊離601DNAを消化した。ヌクレオソーム熱測位前後の比較。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62113/62113fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

ここでは、遺伝子コード拡張を用いてアセチル化ヒストンタンパク質を発現し、再構成されたヌクレオソームをインビトロで組み立てる方法を紹介する。

大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Nanyang Technological University

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JoVE Core

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Biochemistry

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

3.9K ビュー.  Texas A&M University. ここでは、遺伝子コード拡張を用いてアセチル化ヒストンタンパク質を発現し、再構成されたヌクレオソームをインビトロで組み立てる方法を紹介する。

ビデオ: Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

生化学

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

化学

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

生物学

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>1分子研究のためのin situヌクレオソーム再構成

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:単一分子技術のための効率的なヌクレオソーム再構成

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

免疫・感染学

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

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示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション