この作品は、NIH (AI119813)、アーカンソー大学からスタートアップとアーカンソー生物科学研究所から賞によって支えられました。

1 ターゲット遺伝子のサイト指示された突然変異誘発
注: MDH は T7 プロモーター CloDF13起源とコピー数 20 に 4034 pCDF 1ベクトルで表されます。
<ol><li>プライマーによって遺伝子の位置 140 黄色停止コドンを導入 (プライマーを転送: GGTGTTTATGACタグAACAAACTGTTCGGCG、逆プライマー: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC)、サイト指示された突然変異誘発キットの指示に従います。</li>
	<li>野生型リンゴ酸脱水酵素の遺伝子を含んでいるテンプレート プラスミドを増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 反応による停止コドンの変異を挿入します。反応混合物で 2 X DNA ポリメラーゼ酵素ミックス 12.5 μ、10 μ M 前方プライマー、10 μ M 逆プライマーの 1.25 μ、1 μ L テンプレート DNA の 1.25 μ L なども (20 ng/μ L) (pCDF 1プラスミドの野生型 MDH 遺伝子を含んでいる)、ヌクレアーゼ フリー水の 9 μ L。<ol>
<li>PCR 反応パラメーターを使用して、次のように: 30 98 ° C で変性の初期 s;10 の 25 サイクル 98 ° c、30 秒 55 の ° C および 72 ° C、3 分で s72 ° C、3 分で最後の拡張。PCR 後環状とテンプレートの除去の部屋の温度で 1 時間キットからキナーゼ リガーゼ DpnI 酵素ミックスに直接増幅された材料を追加します。 注: 反応混合物には、1 μ L PCR、ヌクレアーゼ フリー水の 3 μ L、1 μ L の 10 X キナーゼ-リガーゼ-DpnI 酵素ミックス、5 μ L 反応バッファー X 2 の製品にはが含まれています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>25 μ L のチューブに反作用の組合せの 5 μ L 解凍有能なエシェリヒア属大腸菌を追加キットから DH5α 細胞。慎重にミックスするチューブをフリックし、氷上で 30 分ヒート ショック 42 ° C、30 秒と場所追加 5 分間氷の上で混合物の混合物を配置します。<ol>
<li>混合物に室温カタボライト抑制 (SOC) メディア キットからスーパー最適スープ 600 μ L をピペット, 250 rpm で振とうしながら 37 ° C, 60 分インキュベート, 対応する抗生物質ホストゲノム スープ (LB) 寒天プレート上に 100 μ L を広める、250 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩インキュベートし、。</li>
	</ol>
</li>
	<li>対応する抗生物質を 6 mL の新鮮な LB メディアに 4-6 シングル コロニーをピックアップし、250 rpm で振とうしながら一晩を 37 ° C で孵化させなさい。製造元のマニュアル、後正しい位置で停止コドンの変異を確認するサービス プロバイダーのプロトコルによると DNA の塩基配列に送信プラスミド プラスミド精製キットで各一晩文化からプラスミドを抽出します。</li>
	<li>1 mL オーバー文化 300 μ L 100 %dmso を混合することによって-80 ° C で正しいシーケンスのひずみを格納します。</li>
</ol>2. アセチル化タンパク質の発現
<ol><li>33最適化された acetyllysyl tRNA 合成酵素の遺伝子を挿入し、tRNA を最適化されたPyl 32 pTechプラスミドに。構成lppプロモーター tRNA 合成酵素遺伝子を配置します。構成proKプロモーター34tRNA 遺伝子を配置します。<ol>
<li>共同式ベクトル34リンゴ酸脱水素酵素の変異タグを含む遺伝子を含むを変換し、による細胞解凍有能なエシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) 25 μ L に最適化された acetyllysine 設立システムを有するプラスミド、10 s、およびさらに 5 分の氷の上の場所のための 42 ° C で熱ショック。</li>
		<li>混合物に室温 SOC のメディアの 600 μ L をピペット、275 rpm で振とうしながら 37 ° C, 60 分インキュベート、100 μ g/mL ストレプトマイシンと 50 μ G/ml のクロラムフェニ コール、プレート上に 100 μ L を広める、275 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>板から単一コロニーをピックアップし、100 μ g/mL ストレプトマイシンと回転数が 250 rpm で振とうしながら一晩 37 ° C で 50 mL のチューブで 50 μ g/mL クロラムフェニ コール 15 ミリリットル新鮮な LB 媒体に接種します。15 mL 一晩かけて培養を 1 L フラスコで抗生物質で 300 mL の新鮮な LB メディアに転送し、250 rpm で振とうしながら, 37 ° C で。</li>
	<li>原液の 100 mM 4 ° C で保存をするために水の acetyllysine を溶解します。吸光度 600 0.5 に達すると成長媒体に 5 mM acetyllysine と 20 mM ニコチンアミド (脱アセチル化酵素の阻害剤) を追加 nm。<ol>
<li>250 rpm で揺れ、37 ° C でさらに 1 時間のための細胞を成長し、蛋白質の表現のための 0.5 mM IPTG を追加 180 rpm で振とうしながら一晩中、25 ° C で細胞を成長します。 注:式の条件は異なった蛋白質のための最適化を必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C 15 分で 3,000 × g で遠心分離によって細胞を収集、上澄みを廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファー (10 mM ナ2HPO4、1.8 mM KH2PO4、137 mM の NaCl、KCl 2.7 mM) 細胞ペレットを洗浄します。10,000 x g で 5 分の 4 ° C で洗浄の細胞を収集、上澄みを廃棄し、細胞ペレット-80 ° C で保存</li>
</ol>3. アセチル化タンパク質の精製
<ol><li>氷の上の凍結細胞ペレットを解凍し、再 15 mL の換散バッファー (50 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) pH 7.8, 300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール、ニコチン酸アミド 20 mM) を持つ β-メルカプトエタノール、1 μ Benzonase ヌクレアーゼ (250 単位) の 5 μ L を中断します。</li>
	<li>30 の間隔で続いて 10 の s 短いバーストの 10 サイクル 70% 出力で 40 kHz 超音波処理によって細胞を壊す形粗抽出物を冷却するための s。4 ° C で 25 分 20,000 × g で遠心分離機原油を抽出します。0.45 μ m メンブレン フィルターで上清をフィルターし、ニッケル ニトリロ三酸 (Ni NTA) 樹脂 20 mL の水と 20 mL の溶解バッファーで平衡の 1 mL を含む列に読み込みます。 注:超音波が利用できない場合、穏やかな洗剤によって細胞を壊さもでした。</li>
	<li>20 mL の洗浄バッファー (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM の NaCl、50 mM のイミダゾール、ニコチン酸アミド 20 mM) の列を洗浄し、2 ml の溶出バッファー (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM の NaCl、150 mM のイミダゾール、ニコチン酸アミド 20 mM) の溶出します。</li>
	<li>PD 10 列、次の製造元のマニュアルでバッファー (25 mM Tris pH 7.8 と 10 mM NaCl) を脱塩溶出画分塩分を除きます。ブラッドフォード蛋白質の試金の試薬の命令に従うことによって溶離されたタンパク質の濃度を測定します。脱塩のタンパク質はさらに実験の準備ができて。 注:蛋白質の 50% グリセロール ストックを行いストレージ-80 ° C で維持します。</li>
</ol>4. アセチル化タンパクの生化学
<ol><li>
SDS ページ/質量分析法による分析。
	<ol>
<li>5 分の 105 ° C で 2 mL チューブにナトリウムの dodecyl 硫酸塩 (SDS) サンプル バッファー (5 μ L タンパク質サンプル 2 μ L 4 X SDS サンプルバッファーで) が付いている蛋白質を変性、10 2000 x g で混合物を遠心分離機 s、4-20% ナトリウム dodecyl 硫酸塩電気泳動法 electroph の負荷oresis (SDS-PAGE) ゲルし 30 分間 200 V で実行します。</li>
		<li>蒸留水でゲルを洗浄し、5 分、3 回繰り返すため軽く振る。水を捨て、Coomassie 青い汚れ穏やかな揺れで 1 時間でゲルを染色します。解除蒸留水でゲルを染色、振盪 30 分し、これは重複染色 3 回繰り返します。</li>
		<li>Coomassie 青いステンド SDS-PAGE ゲル 33 kDa のバンドをカットし、それを質量分析施設や企業、acetyllysine が設計された位置に組み込まれたことを確認するに送信します。 注: 質量分析のプロトコルは続いて前実験34です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
西部にしみが付くこと
	<ol>
<li>SDS ページのゲルを実行手順 4.1 で同じプロトコルを使用します。ゲルを実行後、15 分の転送バッファー (25 mM トリス、192 mM グリシン、pH 8.3、20% メタノール) とゲルを浸します。</li>
		<li>0.2 μ m は、1 分のメタノール 7 × 8.5 cm ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜をアクティブにし、転送バッファー転送サンドイッチを準備する前にすすぎ。 注:メタノールは、皮膚への接触、眼との接触、摂取、または吸入した場合有害。深刻な露出過度は、死に至ることができます。</li>
		<li>(スポンジ、フィルター ペーパー、SDS-PAGE ゲル、PVDF 膜、フィルター ペーパー、スポンジ) 陽極に陰極から転送サンドイッチを作る。350 の定電流で実行転送タンクのスタックを入れて 45 分 mA。 注:転送時間は、最適化を必要があります。</li>
		<li>25 mL 含有トリス緩衝生理食塩水、0.1% と PVDF 膜を洗浄するトゥイーン 20 (TBST) (137 mM NaCl、20 mM トリス、0.1 のトゥイーン 20%, pH 7.6) 穏やかな揺れと 5 分のためのバッファー。室温で 1 時間 TBST バッファーで 5% ウシ血清アルブミン (BSA) で膜をブロックします。</li>
		<li>最終濃度 1 μ G/ml の穏やかな揺れで一晩 4 ° c と 5% BSA TBST 希釈の HRP 共役 acetyllysine 抗体を用いた膜を孵化させなさい。 注:高速な結果を得るには、1 時間室温でこの手順を実行することができます。抗体の希釈には、最適化を必要があります。</li>
		<li>手順を 4 回繰り返して、穏やかな揺れで 5 分 20 mL TBST バッファーを持つ膜を洗浄します。製造元の指示に従い、化学発光基質を膜に適用します。電荷結合素子 (CCD) カメラ ベースのイメージャで信号をキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysyl-tRNA+synthetase:+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool.">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li><li>Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+histone+deacetylase+family:+functional+implications+of+phylogenetic+analysis.">Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis.</a> J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).</li><li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-phosphate+is+a+critical+determinant+of+lysine+acetylation+in+E.+coli.">Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli.</a> Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

NcAA 充電 tRNA によって割り当てられたコドン、ほとんど黄色停止コドン UAG36,37,38,39, の抑制をに基づいて遺伝的非カノニカル アミノ酸 (ncAAs) 定款対応するアンチコドンを含みます。UAG コドンはリリース要因-1 (RF1) 細菌の認識として知られている、それも抑制できる標準的なアミノ酸 (cAAs) によって起訴のホストから同種の Trna 近くリジン、チロシンの40,41など。だから、ncAA 定款の純度は ncAA 充電 Trna 間と同種の Trna 近く cAA 課金競争に依存する一方、UAG コドンで ncAA 定款効率は ncAA 充電 Trna と RF1、間の競争に依存します。低収量とアセチル化ターゲット蛋白質の純度は、宿主細胞に導入した直交ペアの低結合効率によって引き起こされる可能性があります。メディアで acetyllysine の濃度を増やすことでこの問題を解決できるし、最近を使用して最適化 acetyllysine 設立システムは、UAG コドン抑制増の 58 回32,33、両方効率と acetyllysine 設立の純度が向上します。図 1に示すように、タンパク質の収量を比較すると、acetyllysine 設立の効率は約 50% であったし、AcK 設立システムと AcK でなく、MDH の突然変異遺伝子をかくまっている細胞からタンパクの検出はありませんでした。成長媒体は、高純度 acetyllysine 定款を示されています。また、質量分析も表示されませんでした、MDH の 140 の位置に任意の cAAs acetyllysine 設立の同質性を示します。
このアプローチの 2 つの主要な制限があります。まず、両方の RF1 と上記同種 Trna 近く cAA 充電 acetyllysine 充電の tRNA の競争のために現在、単一蛋白質を同時に組み込むことができる acetyllysine 残基の最大数は 333,42。第二に、細胞の脱アセチル化酵素、ニコチンアミドに抵抗し、特定の標的タンパク質を deacetylate 可能性があります他の種類があります。だから、それらの蛋白質は、特定のサイトで 100% アセチル化を達することができません。最近では、acetyllysine43の非 deacetylable アナログとして使用することができますチオ acetyllysine 設立システムを確立して、こうしてこのシステムがこの場合良い方法であります。
前に述べたように、リジンのアセチル化の生化学的特性に古典的なアプローチは、サイト指示された突然変異誘発を使用しています。Acetyllysine の模倣としてグルタミンとアルギニン、リジンのアセチル化非模倣者として利用されています。ただし、両方の模倣は実際ジペプチドイソ スターではない、常に30の期待どおりの結果を得られない。遺伝コードの拡張戦略は、アセチル化蛋白質を特徴付ける最も厳密な方法である特定リジン残基のアセチル化均一タンパク質を生成でした。
Acetyllysine の遺伝的結合システムはピロリジル tRNA 合成酵素の亜種とも真核生物44に直交するように知られているMethanosarcinaceae種からの同種の tRNA のペアから派生しました。前の研究は、哺乳類細胞、タンパク質アセチル化研究39の特定の動物に適用でき、このシステム、従ってこの議定書が哺乳類細胞とも動物医療に広く用に展開に示されています。研究および産業。さらに、このプロトコルはまた宿主細胞に導入した直交ペアに簡単な変更を余儀なく ncAAs の種類を組み込むに使用するのと本質的に同じプロトコルです。
リジンの脱アセチル化酵素 (KDACs) は、蛋白質45アセチル化リジン残基からアセチルのグループを削除します。サーチュイン型コブはニコチンアミド27によって禁じることができるエシェリヒア属大腸菌だけよく知られている脱アセチル化酵素。だから、セル成長および蛋白質の浄化中に生成されたアセチル化タンパク質の脱アセチル化を防ぐためには、バッファーに 20 ~ 50 mM ニコチンアミド必要があります成長の媒体および浄化の両方で追加します。精製、一度リジン残基のアセチル化、脱アセチル化酵素の不足のため比較的安定しています。第二に、低蛋白質、BL21 で他のリジン残基で非特異的なアセチル化の背景 (DE3) 株は式歪みより一般的に使用される K12 由来菌株46 タンパク質アセチル化の有意に低いレベルになってとして使用されました。.図 2に示すように、BL21(DE3) 細胞から表明した野生型 MDH なかった検出アセチル化西部にしみが付くことによって。これは標的タンパク質のアセチル化の純度を高めるためのもう一つの重要な要因です。

タンパク質の翻訳後修飾 (Ptm)、翻訳プロセスの後、遺伝子を含むほぼすべての生物学的プロセスに重要な役割を果たすアミノ酸残基を官能基の共有結合の付加から発生します。転写、ストレス応答、細胞分化、代謝1,2,3。までに、約 400 の特徴的な Ptm は識別された4をされています。ゲノム、プロテオームの複雑さとローカライズ、およびタンパク質の活性を調節する蛋白質、核酸、脂質、補因子5など他の分子との相互作用に影響を与えるタンパク質 Ptm によってかなりの程度まで増幅されています。
タンパク質アセチル化は最後の二十年6,7,8,9,10、11,12Ptm 研究の最前線にされています。リジンのアセチル化最初発見されたヒストンで 50 年以上前1314,,も精査されている、80 以上の転写因子、規制当局、および様々 なタンパク質15に存在する知られています。 16,17。タンパク質アセチル化に関する研究だけでなく、その規制メカニズムのより深い理解を提供してくれました、またガイド数機能不全のアセチル化18,19,によって引き起こされる病気のための治療20,21,22,23. リジンのアセチル化は、真核生物でのみ発生が、最近の調査示したタンパク質アセチル化はまた細菌の生理学、走化性、耐酸性、活性化、安定化など重要な役割を果たしていると考えられていた病原性島と他の病原性関連蛋白質24,25,26,27,28,29。
サイト指示された突然変異誘発にリジンのアセチル化の生化学的特徴を一般的に使用されるメソッドで使用します。グルタミンは、同様の大きさと極性のため acetyllysine の模倣として使用されます。それは生理学的な条件の下で、正の電荷を保持がアセチル化されることができないので、アルギニンがリジンのアセチル化非模倣として活用されています。ただし、両方の模倣は実際ジペプチドイソ スターではない、常に30の期待どおりの結果を得られない。最も厳密なアプローチは、困難または不可能自然7,11にリジンのアセチル化の低い化学量論のための最も古典的な方法である特定リジン残基のアセチル化均一蛋白質を生成することです。この挑戦は組み換えピロリジル tRNA 合成酵素を採用し遺伝コードの拡大戦略で解明されてしている tRNA を充電するMethanosarcinaceae種からバリアントと acetyllysine、Pyl利用ホスト並進機械、UAG を抑制するため、mRNA のコドンを停止し、ターゲット蛋白質31の設計位置に acetyllysine の設立を指示します。最近、我々 はこのシステム改善の EF-Tu 結合 tRNA32とアップグレードされた acetyllysyl tRNA 合成酵素33を最適化してきました。さらに、リンゴ酸脱水素酵素34とチロシル tRNA 合成酵素35のアセチル化研究のこの強化された定款システムを適用しました。ここで、実証例として広く検討したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ (MDH) を使用して、生化学的同定分子クローニングから純粋なアセチル化タンパク質を生成するためのプロトコルを示す.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">5000006</td>
			<td style="width:167px;">Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td style="width:167px;">SDS sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Coomassie G-250 Stain</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td style="width:167px;">SDS-PAGE gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">4-20% SDS-PAGE ready gel</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561093</td>
			<td style="width:167px;">Protein determination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ac-K-100 (HRP Conjugate)</td>
			<td style="width:113px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">6952</td>
			<td style="width:167px;">Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:113px;">CHEM-IMPEX</td>
			<td style="width:119px;">194</td>
			<td style="width:167px;">Expression inducer</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">N&#949;-Acetyl-L-lysine</td>
			<td style="width:113px;">CHEM-IMPEX</td>
			<td style="width:119px;">5364</td>
			<td style="width:167px;">Noncanonical amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">PD-10 desalting column</td>
			<td style="width:113px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17085101</td>
			<td style="width:167px;">Desalting</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:113px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E0554</td>
			<td style="width:167px;">Introducing the stop codon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">BL21 (DE3) cells</td>
			<td style="width:113px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">C2527</td>
			<td style="width:167px;">Expressing strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:113px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
			<td style="width:167px;">Extracting plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ni-NTA resin</td>
			<td style="width:113px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">30210</td>
			<td style="width:167px;">Affinity purification resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">nicotinamide</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3376</td>
			<td style="width:167px;">Deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td style="width:167px;">Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BugBuster Protein Extraction Reagent</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">70584</td>
			<td style="width:167px;">Breaking cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E1014</td>
			<td style="width:167px;">DNase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td style="width:167px;">Chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Premixed LB Broth</td>
			<td style="width:113px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97064</td>
			<td style="width:167px;">Cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:113px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97061-416</td>
			<td style="width:167px;">western blots blocking</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facile protocol to generate site-specifically acetylated proteins in escherichia coli

ポスト翻訳の修正蛋白質の特定の位置で発生するさまざまな細胞プロセスで重要な役割を果たすに示されています。その中で、リバーシブルのリジンのアセチル化の一つです最も広く分散の生活のすべての領域でさらに多くの acetylome の質量分析を用いた研究が行われているが、これらの推定のアセチル化ターゲットの特性は制限されています。1 つの可能な理由はほとんどの古典的な生化学的アプローチによって目的の位置でアセチル化された純粋なタンパク質を生成する難しさ。この課題を克服するために遺伝コードの拡張手法が適用されて翻訳共役の設立を指示するペア組み換えピロリジル tRNA 合成酵素バリアント、およびMethanosarcinaceae種からの同種の tRNA を使用するには興味の蛋白質の特定のサイトで acetyllysine のヒストンのアセチル化の研究では、最初のアプリケーションの後、このアプローチは、様々 なタンパク質のアセチル化研究を促進しています。この作品では、ホストとしてモデル細菌エシェリヒア属大腸菌を用いた site-specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコルを示した。リンゴ酸脱水素酵素は、この作品での実証例として使用されました。

アセチル化 MDH タンパク質の収量野生型 MDH のあった 1 L 文化あたり 31 mg 1 L 文化あたり 15 mg であった。図 1に示すように、浄化された蛋白質は SDS のページによって分析されました。野生型 MDH は34の肯定的な制御として使用されました。成長媒体の細胞の acetyllysine (AcK) 設立システムと変異mdh遺伝子から、AcK を返さずを精製したタンパク質は、ネガティブ コントロールとして使用されました。浄化された蛋白質のリジンのアセチル化は、西部しみが付く使用して図 2に示すように、acetyllysine 抗体によって検出されました。リンゴ酸デヒドロゲナーゼのリジン残基 140 のアセチル化は、図 3に示すように、タンデム質量分析によって確認されました。
(タンデム質量分析のためのフラグメントは太字で) MDH 蛋白質の蛋白質シーケンス:
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
最適化された acetyllysyl tRNA 合成酵素33:の蛋白質シーケンス
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
最適化された tRNA の遺伝子シーケンスPyl 32:
GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC ACGTTTCCGCCA
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57061/57061fig1.jpg"> 図 1: 精製フルレングス MDH の AcK を含むバリアント、Coomassie 青いステンド SDS-PAGE ゲル。溶出画分は SDS のページに読み込まれた同じボリュームのゲルします。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57061/57061fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57061/57061fig2.jpg"> 図 2: 野生型 MDH の精製とその AcK を含むバリアントの西部にしみが付くこと.溶出画分の同じボリュームが読み込まれました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57061/57061fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57061/57061fig3.jpg"> 図 3: MDH の AcK を含むバリアントのクロマトグラフィー-タンデム質量分析します。タンデムの質量スペクトル ペプチド (残基 135-142) AGVYDKACNK 精製アセチル化 MDH バリアントから。KACは、AcK 定款を示します。AcK を含むペプチドの部分シーケンスは、注釈付きの b や y イオン シリーズから読むことができます。一致するピークは赤であった。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57061/57061fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

遺伝コードの拡張は、タンパク質アセチル化を含む、生物学的プロセスの広い範囲を研究するための強力なツールとして機能します。均一に生成するためのこの手法を悪用する安易なプロトコルをアセチル化したタンパク質の大腸菌細胞の特定のサイトを示します。

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

a-facile-protocol-to-generate-site-specifically-acetylated-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

6.8K ビュー.  University of Arkansas. 遺伝コードの拡張は、タンパク質アセチル化を含む、生物学的プロセスの広い範囲を研究するための強力なツールとして機能します。均一に生成するためのこの手法を悪用する安易なプロトコルをアセチル化したタンパク質の大腸菌細胞の特定のサイトを示します。

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Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

免疫・感染学

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

神経病原の非侵襲的モデル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;新生ラットにおける感染

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

ワンステップの負のクロマトグラフィー精製<em&gt;ヘリコバクター・ピロリ</emで過剰発現&gt;好中球活性化タンパク質<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;バッチモードでの

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

形態変化を特徴付けるプロトコル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;抗生物質治療に対する反応

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

ヒトの過剰発現と精製<em&gt;シス</em&gt; - プレニルトランスフェラーゼ<em&gt;大腸菌</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.