TO と TD はそれぞれ、JSPS KAKENHI 認可番号 19H02970 と 20H02999 によってサポートされました。

1. 実験室コロニーのメンテナンス
<ol><li>野生型および変異体集団の維持のために、通常の人工魚の食糧を備えた大きいプラスチック容器(460 mm x 360 mm x 170 mm)、上部に換気穴があるプラスチックコップの水、昆虫を隠す折り紙、そして卵を産む層状綿を使用する(図2A)。すべての T.家産 培養物を37°Cインキュベーター内に保管し、各容器内の相対湿度(RH)を60~80%に設定します。 注 :T.家電は 大気11から水蒸気を吸収するので、直接給水は必要ありません。適切なRHは、上部に換気穴を含むプラスチックカップまたは各容器内の蓋なしのカップからの水蒸気の存在のために維持される。培養物を含むインキュベーター全体の中で加湿する必要はありません。このプロトコルで説明されている条件下での各開発段階の概算の持続時間を 図 1に示します。発達速度は、温度やRH12を変更することによって調整することができます。</li>
	<li>定期的に食べ物を追加します。水が乾く前に水を加えます。</li>
	<li>成人が汚れた環境や人口密度の高い環境で卵を産むのをやめていることを考えると、少なくとも3ヶ月ごとに新しいクリーンコンテナに集団を移す( 議論を参照)。</li>
</ol>2. 卵の採取とマイクロインジェクション
<ol><li>ガイドRNA(gRNA)を設計する<ol>
<li>必要な各標的に対してgRNA配列を設計し、ゲノムアセンブリに対してgRNA配列をBLASTして、可能なオフターゲット認識部位をチェックする。</li>
		<li>メーカーの指示に従ってgRNAを合成し、精製する 8. 注:例として、ATP結合カセットトランスポーター 白色 遺伝子を標的とする場合、20bp標的配列を設計し、2つの合成DNAオリゴヌクレオチド5'-TAATACGACTATATATAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGAC-3'および5'TTCTAGCTCTAAAACATCGCGCGCGCGCGGTACAACACTTA-3'を命じた。DNAテンプレートは、これら2つのオリゴヌクレオチドをアニールしてPCR増幅し、次いでgRNAをT7 RNAポリメラーゼで鋳型からインビトロに転写して調製した。</li>
	</ol></li>
	<li>卵のコレクションのコロニーを準備します<ol>
<li>約20人の男性と20人の女性の成人を中型容器(200mm x 150mm x 90 mm)に、食料、給水、折り紙、および産卵用の小さな層状コットンを入れ替える(図2B)。</li>
		<li>ゲノム編集に使用する短期間で多数の段階的胚を得るために、いくつかのコロニーを設定する。 注:約20〜40個の卵は、37°Cで8時間後にコロニーから採取される予定です。 通常、新しい環境への適応のために、転勤の成人が卵を産み始めるのに数日かかります。</li>
	</ol></li>
	<li>注射の日に、容器の中の綿を新しいものに交換してください。</li>
	<li>76 mm x 5 mm 両面テープを通常の 76 mm x 26 mm ガラス スライドに貼ります。</li>
	<li>8時間後、鉗子を使用して層を分離することによって、層状綿から卵を収集します。</li>
	<li>濡れたペンキのブラシを使って両面テープに卵を合わせ、卵の間に2mmの距離を保ちます。卵の縦軸が注入側に向かるように、すべての卵の向きを設定する必要があります(図3A)。注入の間にしっかり保持するためのペイントブラシで卵をそっと押し下げます。 注:このプロトコルでは、真菌は濡れた暖かい状態で損傷した注入された卵で速く成長します。卵の間の距離を保ち、クロス汚染や真菌の膨張を防ぐことが重要です。</li>
	<li>gRNAとCas9タンパク質を、それぞれ100 ng/μLと500 ng/μLの最終濃度に混合します。蒸留水を希釈に使用してください。リボヌクレオタンパク質複合体形成を促進するために室温で10分間ミックスをインキュベートし、氷の上にミックスを保ちます。 注:1%の最終濃度でニュートラルレッドを注入溶液に加える可能性があり、注入された量を監視することができます。</li>
	<li>マイクロローダーを使用してガラス注入キャピラリーにgRNA/Cas9溶液の2μLをロードします。注入前に溶液に気泡がないことを確認してください。必要に応じて、針をタップして気泡を取り除きます。 注: この実験では、既製の針を使用して細かい針先を得ます(図3B)。代わりに、似たような形の自家製針を使用することができます。</li>
	<li>以前にgRNA/Cas9溶液を搭載したガラス注入毛細管をマニピュレータを装備したホルダーに固定し、ホルダーを電子マイクロインジェクターに接続します。</li>
	<li>針先の形状を、詰まりを防ぎ、一連の注射を通してより優れた耐久性を得るために鉗子でわずかに壊すことによって、針先の形状を最適化します(適切な針の例を 図3Cに示します)。 メモ:詰まった針を変更することをお勧めします。鉗子で再び壊れた場合、同じ針を注入し続けることは可能ですが、より広い先端はより多くの卵の損傷をもたらし、生存率を低下させる。 T.家畜卵 は柔らかく壊れやすいので、注射後の生存率が高いために細かい針先を保つことが重要です。</li>
	<li>卵の縦軸の中点に針を挿入し、わずかな量の溶液を注入します(注射量の参照については 図3D–H を参照)。注射時に、針先の形状に応じて電子マイクロインジェクターの構成を調整します。 注:注射中に一定の圧力を加えることをお勧めします、そうでなければ粘着性の卵の内容物は、ガラス針に簡単に流れ込み、それを詰まらせることができます。溶液は、注入される液体の量に応じて、短い圧力パルスまたは一定の圧力で注入することができる。針の先端が広い開口部を持つ場合、あまりにも多くの溶液が卵に注入され、致死性を引き起こすことに注意してください(図3F-H)。その場合、一定の圧力で液体の流れを一定に保ち、針を卵に挿入してすぐに引き出します。それがあまりにも多くのオーバーフローを引き起こすか、卵が破裂した場合は、針を変更します。</li>
	<li>注入した卵の数に適したサイズの容器に入れておきます (<20 卵: 小皿; >20卵: 中型容器) 60%-80% RHと37 °C.</li>
</ol>3. 交配
<ol><li>注入された卵を定期的にチェックし、損傷した卵を鉗子で捨てて真菌の増殖を避ける(図3I,J)。卵の上にあまりにも多くの真菌が成長している場合は、70%のEtOHで卵の表面をきれいにします。</li>
	<li>孵化前(産卵後37°Cで約10日間)、注入した卵を入れたガラススライドをタルカムパウダーに浸し、両面テープの表面をコーティングします。これは、孵化したニンフの積み重ねを避けるでしょう。粉末コーティングされたガラススライドを、昆虫を隠すために食べ物、水、折り畳まれた紙を入れた中型容器に移します。</li>
	<li>ニンフが孵化した後、ガラスのスライドを取り外します。成人になるまで定期的に食料を供給する。 注:孵化後、成人に達するまでに約2.0~2.5ヶ月かかります(図1A)。成人期は、女性の発達したオビポジターに基づいて判断される(図1B)。</li>
	<li>個人を交尾するには、必要な数の野生型の女性成人を実験室のコロニーから中型容器に移し、37°Cで少なくとも14日間インキュベートして処女であることを確認します。 注:成人T.家畜は「生殖と脱皮サイクル」と呼ばれる脱皮と交配の繰り返しサイクルを持っているので、実験室のコロニーから処女の女性を収集する必要はありません。</li>
	<li>注射卵と野生型の大人から発達したオスまたはメスのG0成人を、食べ物、折り紙、G1卵を産む綿の小片を入れた小さなプラスチック皿(Ø 100 mm x 40 mm)に移します(図2C';交配皿)。交配皿を60%~80%RHの大きな容器に入れておいてください(図2C)。 注:1対1のペアリングで高い成功率が達成されているが、成功率が高いが、成功率が高いが、複数の野生型の大人を皿に含めることができる。</li>
</ol>4. ジェノタイピング
<ol><li>各gRNAにPCRプライマーペアを設計して、gRNAの標的部位を含む100~200bpの産物を増幅します。その特異性を確認するためにゲノムアセンブリに対して各プライマー配列をBLASTする(図4Aにおける白色遺伝子の標的化の例を示す)。</li>
	<li>G0成人の生殖系列変換を確認してください。<ol>
<li>卵が産まれた5日後、各G0成人ペアから0.2mLチューブに個々のG1卵を採取する(1株当たり1個の卵、収集したサンプルを-20°Cで長期保存する)。卵を収集するために綿の層を分離します。 注:生殖系列伝達の成功を評価するために、各交配ペアから少なくとも12 G1ニンフを遺伝子型化することをお勧めします( 代表結果を参照)。</li>
		<li>各チューブに0.25 mg/mLプロテイナーゼK溶液(トリスEDTAバッファーに溶解)を15μL加え、サンプルを爪楊枝で短時間均質化し、55°Cで3〜16時間インキュベートします。</li>
		<li>95°Cで10分間サンプルを配置することにより、プロテアーゼKを不活性化します。</li>
		<li>各チューブに90μLの蒸留水を加え、よく混ぜます。ステップ4.1で設計されたプライマーを含む10 μL PCR反応ミックスで2μLの上清を使用してください。 注: 粗テンプレート用に最適化された DNA ポリメラーゼを使用すると、十分な PCR 増幅が得られるようにすることをお勧めします。</li>
		<li>PCR産物を解析するには、マイクロチップ電気泳動システムを用いてヘテロデュプレックスモビリティアッセイ(HMA)を実行する(図3B;Ohdeら、2018を参照)。 注:突然変異は、2つの代替方法で評価することができます:(1)標準ゲルポリマーを有するHMA(例えば8%ポリアクリルアミド14;(2)T7エンドヌクレアーゼを用いたPCR産物の消化、続いてアガロースゲル電気泳動15.</li>
		<li>生殖細胞系列に変異を含むG0成人から生じるG1ニンフのみを保管し、他の人を捨てる。</li>
	</ol></li>
	<li>G1ニンフ/大人の個別ジェノタイピング<ol>
<li>G1ニンフを吸引器またはペイントブラシで24ウェルプレートに分離します。24ウェルプレートを大きな容器(例えば、このプロトコルで使用される中型コンテナ)に、上記のように給水で配置し、RHを60%~80%に保つ(図1D)。人工的な通常の魚の食糧の供給を維持する(図1D')。 注:このステップはニンガルステージと成人段階のどの時点でも実行できますが、成人期に達した後、ペアリングの直前に実行することをお勧めします(>注射後2.5ヶ月; 図 1B)大きな容器にファブラットを維持する方が簡単だからです。個々の飼育は、次の手順で各G1ニンフの遺伝子型を追跡するために必要とされる。同じG0成体からのG1ニンフは異なる突然変異を有することができる。</li>
		<li>鉗子を使用してニンフ/成体からcerciとコーダルフィラメントをつまんで引っ張り、50 μL EtOHを含む0.2 mLチューブに集めます(収集したサンプルを-20°Cで長期保存してください)。 注:ティッシュサンプルは静電気によるこれらの小さいサンプルの損失を防ぐのでEtOHで集められる。昆虫の動きを止める必要がある場合は、組織サンプルを採取する際に氷上でニンフ/成体を麻酔します。 T.家畜は 氷の上で長期間冷却した後に生き残ることができないので、1分以上麻酔せず、すぐに室温に戻してください。セルシと尾状フィラメントのアブレーションは、死亡率の増加を引き起こさない。</li>
		<li>サンプルチューブを熱ブロックに開けて70°Cで15分間開き、EtOHを蒸発させておきます。</li>
		<li>ジェノタイピングの場合は、ステップ 4.2.2 ~ 4.2.5 を繰り返します。</li>
		<li>変異バンドパターンが観察されたPCR産物を、標準のサンガーシーケンシングサービスに提出します。</li>
		<li>G1ニンフ/成人に所望の変異を保持し、他の変異を破棄します(代表的なシーケンス結果については 図4C を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>交配皿に所望の突然変異を含む成人を渡り、次の世代を得てホモ接合突然変異株を確立する。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. 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Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

CRISPR/Cas9を用いた所望の T.家畜 変異体の生成に成功するためには、注射のために十分な数の段階的胚を収集することが最初に重要である。十分な数の T.家畜 卵の一定のコレクションの場合、重要なのは、すべての成体モルト13の後に繰り返される一連の複雑な交配行動の正常な完了を助けるので、より低い人口密度を有する容器の適切なサイズを選択することです。男性 のT.家畜成人 は、精子を介して女性に間接的に精子を移す。Sweetman(1938)は、男性成人が交配行動の開始から精子12の配置まで20〜35分かかると報告した。他の個体による交配ペア間の相互作用の妨害は、密な環境でより頻繁に起こり得る受精の成功を妨げる可能性が高い。
卵は、私たちのプロトコルで十分な卵を収集するために容器の中に綿を交換した後8時間で収集されますが、注入された材料が核の大部分に送達される機会が多い場合、卵子を収集し、より短い時間(例えば、産卵後4時間)に注入することによって、ゲノム編集の高い効率を達成することができます。より短い時間内に十分な数の卵への注入は、(1)空間が許せば容器の数または大きさを増やすことによって行うことができ、または(2)十分な数の注入卵を得るために同じ手順を繰り返す。
注射部位は一般に昆虫の生殖細胞系列の変換を成功させるために重要であると考えられる。 T.家畜卵 は通常楕円体の形をしており、長手方向軸の1極に胚芽帯を含む。 T.家畜 卵の可変形状のために初期胚で胚バンドが形成される極を特定することは困難であるため、gRNA/Cas9混合物を卵長手軸の中間点に注入することが推奨される。gRNA/Cas9溶液は生殖バンド形成部位に直接注入されるわけではないが、我々は8人のG0成人の39.1%もの高い生殖系列の形質転換を達成した。
卵のマイクロインジェクションの間、他の動物モデルの場合と同様に、高い生存率を得るために細かい針先を使用することが重要です。 T.家畜 卵に自家製ガラス針を使用した場合よりも、既製の針で注射後の生存率が高くなりました。しかし、同様に高い生存率は、自家製の針で細かい針の形を複製することによって達成することができる( 図3B,Cに示すように)。我々の経験によると、ドライインジェクション法は、以前に報告された湿式注入方法8よりも高い生存率をもたらす。乾燥した環境での卵のインキュベーションは 、T.家畜 卵と初期のニンフが乾燥に耐性であるという事実を利用して、この改善の鍵であることがわかりました。これは、この種が特に初期の発達段階で乾燥した環境を好み、湿潤環境が有害である可能性があることを示唆する以前の報告に従ってである 16.プラスチック板の代わりに、アガロースゲルは卵の迅速なアライメントに使用することができます。しかし、注入した卵を乾燥面に移すことで生存率が高くなります。
結論として、我々の方法は 、T.家産の ユニークな生物学をゲノム編集の成功に考慮することの重要性を強調している:卵の十分な数を収集するためのまばらな環境と注入された胚のより高い生存率を有するための乾燥した環境を維持する。ここで報告される注射、交配、培養の基本的なプロトコルは、ゲノム編集による変異株の生成だけでなく、RNAiやトランスジェネシスなどの他の遺伝子ツールの応用にも使用され、昆虫の初期進化の根底にあるメカニズムを理解するのに役立ちます。

熱藻家畜は、最も基礎的な昆虫の注文の1つに属しています, Zygentoma, 先祖の代謝と翼のないライフサイクルを保持します.このような基底系統的位置と先祖の特徴は、この種を地球上の昆虫の成功の基礎となるメカニズムを研究するための魅力的なモデルとして設定し、記述された動物種の70%以上をカバーする1。T. 家産は、比較的短いライフサイクル(胚から生殖成人までの2.5~3.0ヶ月)などの実験室モデルとして適した特徴があるため、主に昆虫生理学の祖先特性を研究するために主に使用されてきました。図 1A)そして簡単な繁殖。過去30年間で、ボディプラン、神経分化、概日リズム2、3、4などの様々な形質の祖先の特徴を調査するために、その使用が拡大されました。
T.家産における高度な遺伝ツールの適用は、広い研究分野におけるこのような貢献をさらに加速させる可能性がある。胚、ニンフ、および成人におけるRNA干渉(RNAi)媒介遺伝子ノックダウンがT.家畜4、5、6で報告されている。全身RNAiの効率は依然として種に依存性が高く、例えば、コレオプテラでは一般的に高いが、鱗翅目の順序は7.T.ドメダナのRNAiノックダウンの効率と持続時間はまだ評価されていません。RNAiに加えて、我々は以前にT.家産8で成功したCRISPR /Cas9媒介遺伝子ノックアウトを報告しました。CRISPR/Casシステムは、特に標的遺伝子ノックアウトの昆虫のゲノム編集に広く応用されています。その使用は、CRISPR/Casシステムの成分を核9に送達するためのプロトコルの確立後に、遺伝子レポーターアッセイ、細胞系譜追跡、およびノッキングイン外因性構造による転写活性の操作などの他の用途に拡大することができる。公表されたゲノムアセンブリ10と組み合わせることで、T.家畜におけるCRISPR/Casベースのゲノム編集の広い使用とさらなる発展は、昆虫の顕著な適応成功の背後にある進化メカニズムに焦点を当てた研究を容易にするだろう。ここでは、胚微小注入とCRISPR/Cas9を用いて変異株を生成する成人T.家産を交配するための詳細なプロトコルについて説明する。この新しい方法を考えると、我々はこれらの技術の成功した応用のための非伝統的なモデル種の独特な生物学を考慮することの重要性を議論する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

ファブレット サーモビア家畜は 、地球上で成功した進化放射線につながった昆虫の発達メカニズムを研究するのに適した代謝された翼のない種です。ゲノム編集などの遺伝的ツールの応用は、Evo-Devoアプローチにおける進化的移行を担う遺伝的変化を理解する鍵です。この記事では 、T.家産の変異株を生成し、維持するための現在のプロトコルについて説明します。我々は、報告された湿式注入法の代替として、注入された胚において安定的に高い生存率を得ることを可能にする乾燥注入方法を報告する。また、成人との交尾を行い、その後の世代を高効率で取得するための最適化された環境設定を報告します。我々の方法は、非伝統的なモデル生物にゲノム編集方法をうまく適用するために、種固有の生物学を考慮に入れる重要性を強調している。これらのゲノム編集プロトコルは 、T.家畜 を実験室モデルとして実施し、この種における有用な遺伝ツールの開発と応用をさらに加速させるのに役立つと予測しています。

私たちの手では、十分な先端を持っている場合、約100個の卵が単一の注射毛細管で十分に注入することができます(図3C)。産卵後の最初の8時間以内に胚中にgRNA/Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を注射すると、gRNA標的部位にインデルが生じる。これは、注入された生成のいくつかの細胞(G0)におけるビアレスリック突然変異を引き起こし、したがって変異モザイクの型は、通常G0で得られる。例えば、このプロトコルを用いて白色遺伝子を標的とするgRNAを注入した場合、G0ニンフの32.6%がそれらの化合物眼および後方領域における色素沈着の部分的な損失を示す(図5)8。
現在記載のドライ注射法を用いて、80~120個の卵子を注入すると、注入された胚の生存率は40%~60%と高い。これは、卵をアガロースプレートに注入して維持する以前の湿式注入法とは対照的であり、時には生存率が10%未満になる。
G0成人および変異G1個体の生殖細胞系列変換の評価は、ゲノムPCRに続いてHMAによって行われた。HMAにおいて、野生型および変異型アレルアニールは、各々可能な組み合わせにおいて、これは典型的にはゲル電気泳動(2つのホモデュプレックスおよび2つのヘテロデュプレックス)14上で4つの異なるバンドをもたらす。G1サンプルでは、野生型と変異したサンプルの間の差動バンドパターンは明確に区別可能である(図4B)。生殖細胞系の形質転換は 、白い 遺伝子8を標的としたG0成人の39.1%に見られた。私たちの経験では、G1ニンフの変異した個人の単一のG0ペアからの割合は25%から100%まで変化します。
交配環境が交配の成功に及ぼす影響を評価するために、交配皿で野生型の成人を交配し、95.8%(23/24ペア)の成功率を得ました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61885/61885fig01.jpg"> 図1:T.家産のライフサイクル(A) T. 家産の各開発段階の概算期間。(B) 成人女性のドーサルビュー矢印は、よく発達したオビポジターを示す。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61885/61885fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61885/61885fig02v3.jpg"> 図2:このプロトコルで使用されている人工環境(A) 実験室コロニー用の大きな容器、(B)卵の採取用の中型容器、(C)大きな容器に水供給を入れた料理を交配し、交配皿を、中型容器に水を供給する24ウェルプレート。箱入り領域はT.家産体の個人を示すために(D')で拡大されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61885/61885fig02v3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61885/61885fig03.jpg"> 図3:T.家畜卵のドライ注入。(A)卵はガラスのスライドに整列します。黒い矢印は、針が挿入されるポイントを示します。(B)注射に使用するガラス針先端の形状。(C)先端を壊す前(上)と後(下)の同じガラス針。針は1%のニュートラルレッドで満たされた。矢印は針の先端を示す。スケールバーは1mm(D)未注入卵です。(E) 注射の良い例。矢印は射出のポイントを示します。(F – H)溶液は注入された部位(F)または注入された卵の反対側(G)からあふれている。注入の量が多すぎるとバースト(H)が発生した。矢印は、オーバーフローした卵の内容を示します。(私は) 通常は後期胚を発症した。矢印は、色付きの複眼を示す。(J)注射後3日後に卵を縮めた。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61885/61885fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61885/61885fig04.jpg"> 図4:G1個体のジェノタイピング(A)PCRプライマーは、gRNA標的部位を含む120bpゲノム領域を増幅するように設計されている。(B) 同二重およびヘテロデュプレックスの複数のバンドが変異サンプルで検出され、単一バンドは変異していないサンプルで現れる。L:DNAラダー、U:変異していないサンプル、M:変異サンプル。(C)野生型およびヘテロ接合変異体サンプルからのPCR産物の直接シーケンシングの代表的な結果。野生型と変異型 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61885/61885equ01v2.jpg"> ()アリールの配列が上に示されている。(A)に示す前方プライマーをシーケンシングプライマーとして使用した。ヘテロ接合変異体の配列(下)は、予測切断部位(arrow)から2つの重複する配列によって示される。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61885/61885fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61885/61885fig05.jpg"> 図5:gRNA/Cas9タンパク質注射で 白色 遺伝子を標的とした後の化合物眼および後部領域における色素沈着のモザイク損失。(A) ワイルドタイプおよび (B) 白い gRNA/Cas9 タンパク質注入最初のインスターニンフ.目(矢印)および後方領域(矢印)における黒およびピンク色素沈着の部分的な損失が示されている。スケールバーは200 μmです。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61885/61885fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電 の効率的な交配のための詳細なプロトコルを提供する。

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K ビュー.  Kyoto University. 我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電 の効率的な交配のための詳細なプロトコルを提供する。

ビデオ: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

発生生物学

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

ポスト交配精液女性の生殖器官とマウスの精液の液状化測定からのコレクション

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...