この方法の全体的な目的は、組織特異的な標的発現系を生成することである。この方法では、我々のショウジョウバエFGFホモログに特異的なバイナリ転写ドライバの生成を実証した。枝のない動的で時空間的な発現は、気管気道上皮の枝の血行形成を調節する。
この方法は、枝分かれのない産生細胞の時空間的発現および移動に関する洞察を提供することができるが、ショウジョウバエまたはC.Elegansおよびゼブラフィッシュのような他のモデル生物の他の遺伝子および組織に容易に適用することができる。この技術の主な利点は、信頼性が高く、組織および遺伝子特異的であり、置換された遺伝子のシス調節要素が機能する細胞内で排他的に活性である発現系を生成することである。バイナリ転写システムは、標的遺伝子発現および操作に不可欠なツールです。
GAL4やLexAなどのトランスアクチベーターは、遺伝子のシス調節要素の制御下で発現され、GAL4のUASやLexAのLexOのような特定の転写結合部位の下流に配置されたエフェクタートランス遺伝子を駆動します。この方法論は、分岐のない遺伝子の最初のコーディングエキソンを転写ドライバに置き換えます。CRISPR Cas9ベースの方法は、LexAトランスアクチベーター配列を分岐のない遺伝子の内因性調節下に配置し、その結果、分岐のない特異的時空間パターンにおいてトランスアクチベーター発現を促進する。
まず、選択した対象領域の2つの端を特異的に標的とする2つのガイドRNA標的部位を選択します。CRISPR デザインツールを開きます。フライCRISPR最適ターゲットファインダーはここで使用されています。
[ゲノムの選択]をクリックして目的のシーケンスを挿入し、ドロップダウンメニューから最新のアップロード済みショウジョウバエメラノガスターゲノムアノテーション(現在Rアンダースコア6)を選択します。次に、[ガイドの長さを選択]をクリックし、入力20をクリックします。[すべての CRISPR ターゲット] を選択し、[CRISPR ターゲットを検索] をクリックします。
すべての候補ガイドRNAターゲットを、PAMのストリンジェンシーおよびNGGのみの最大値を設定して評価します。タンデムガイドRNA発現ベクターを生成するために、まずPCRはDNA断片を増幅し、2つのプロトスペーサー配列をpCFD4 RNA発現ベクター骨格に導入する。前方および逆プライマーを使用し、それぞれプロトスペーサー配列を有し、高忠実度ポリメラーゼおよびpCFD4テンプレートDNAを使用したPCRでpCFD4ベクター配列と重複する。
クローニング用のpCFD4を調製するには、プラスミドをBbs1酵素で消化します。pCFD4プラスミドの2〜5マイクログラムとBbs1酵素の1マイクロリットルと50マイクロリットルの最終体積を含む適切な消化バッファーに反応を設定します。チューブをタップし、短いスピンでチューブの壁から底まで、すべての散乱液滴を集めることによって、反応内容物を混ぜます。
PCR産物を実行した後、2時間摂氏37度で反応ミックスをインキュベートし、1%のアガロースゲルでプラスミドを消化します。標準ゲル精製カラムを使用して、6.4キロベースペアリニアプラスミドおよび600塩基ペアPCR産物を精製します。メーカーのプロトコルに従ってDNAアセンブリ反応を設定します。
GAL4またはLexAシーケンスのゲノムノックインの場合、トランスアクチベーター配列を含む二本鎖HDRドナーを2つの相同性アームで設計します。ガイドRNAを操作した軌跡に再ターゲティングすることを避けるために、ガイドRNA認識部位が導入された外因性配列によって破壊されるように、代替ドナーを設計します。また、シス調節元素の純度を変化させないために、必ずコーディングエキソン領域内のガイドRNA認識部位を選択してください。
置換カセットを生成するには、4 つのセグメントを結合する DNA アセンブリ戦略を計画します。5つの素数および3つの素相同性アーム、中外外性トランスアクチベーターDNA配列、および線形化クローニングベクター骨格を有する。PCRは適切なベクターからGAL4またはLexA発現カセットを増幅し、PCRは注射用に選択された親フライラインから抽出されたゲノムDNAから相同性の腕を増幅する。
各 PCR で高忠実度ポリメラーゼを使用して、ターゲットフラグメントを生成します。DNAアセンブリ反応をセットアップするには、PCRクローニングによって生成されたリニア化クローニングベクターとターゲットフラグメントをDNAアセンブリマスターミックスと、最終反応量をメーカーの指示に従って20マイクロリットルに混合します。反応ミックスを摂氏50度で1時間インキュベートします。
以前にガイドRNA発現プラスミドと代替ドナーの両方を注入したNos-Cas9胚が成人に発展すると、G0を横切って個別に飛び、標的となるアリールに適したラインからハエのバランスを取ります。二酸化炭素パッド上の各G0クロスからF1子孫を麻酔します。ステレオ顕微鏡の下で10〜20人の男性を無作為に選ぶ。
個別にターゲットアレーレに適したラインからバランサメスに選択した各男性を横断します。F2幼虫が孵化したら、各十字架からF1の父親を選びます。ピペットチップで各フライを10〜15秒間押しつぶし、バッファーを分配せずに50マイクロリットルのスクッシュングバッファを含んでゲノムDNAを抽出します。
その後、残りのバッファーをチューブに分配し、よく混ぜます。摂氏37度で20~30分インキュベートします。インキュベーションに続いて、チューブを95°Cのヒートブロックに1〜2分間入れてプロテナーゼK.を不活性化し、G10,000倍で5分間回転した後、さらにPCR分析のために摂氏4度で調製を保存します。
3段階PCRベースのスクリーンをプライマーを1つ前方にして実行し、挿入または置換の存在をスクリーニングするために1つを逆にします。3つの素数領域からの挿入または置換を検証するために、2つのプライマーを前方および逆2つのプライマーを使用してPCRを行います。プライマーM13Fを使用してPCRを実行し、3つを逆にしてエンドインHDRをチェックします。
確認されたエンドアウト'HDRでフライラインを維持し、F2世代からバランスの取れた株式を確立します。他の染色体の意図しない突然変異を取り除くために、バランサが再び飛ぶアウトクロス。枝分かれ、またはbnl発現は、第3のインスター幼虫翼円盤において赤で、緑色で示される受容体の息をのむような発現細胞を有し、成長する空気嚢プリモルジウムに示される。
分岐のない発現細胞はTR5横方向結合枝およびTR2後部分岐にここに示される。息を切らして発現する気管細胞を緑色でここに示す。呼吸のない発現細胞は緑色で示され、発育中の胚気管をステージ9からステージ14にマーキングし、分岐のない発現細胞を赤色で示している。
この画像は、制御に対して、低酸素状態下の異所組織の位置で誘導される分岐のない発現を示す。この方法は、分岐のない遺伝子転写の全ての元の時空間的な規則を保持するように設計された。したがって、遺伝子の最初のコードエキソンのみをLexAトランスアクチベーターコード配列に置き換える必要がありました。
その開発後、この新しい遺伝的ツールセットは、分岐のない遺伝子の新しい組織発現パターンを探求する道を開いた。また、遺伝子の誤発現を可能にし、分岐のない発現細胞で独占的にノックダウンし、細胞の直線的な移動およびシグナル伝達相互作用の監視に役立った。
