この作業は、NIA R00 AG053412 (KEF) によってサポートされました。

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って、動物を含む生物医学研究のための国際指導原則に従って行われました。この議定書は、ノースカロライナ大学シャーロット制度動物の世話と使用委員会(プロトコル#19-020)によって承認されました。
1. 文化の準備
注:これらの手順は、組織培養指定のバイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行う必要があります。メディアとソリューションについては 、表 1 を参照してください。
<ol><li>自己シール滅菌袋でオートクレーブすることにより、すべての解剖ツールを殺菌します。</li>
	<li>12ウェルの文化料理を扱うためのポリD-リジンの作業ストックを準備します。<ol>
<li>ポリD-リジンを1xホウ酸バッファーに100 μg/mL(10x濃縮)の濃度に溶解します。必要になるまで-20°Cで約1mLのアリコートを保管してください。</li>
		<li>10倍濃縮ポリD-リジンをdPBSで10μg/mL(1x)に希釈し、フィルター滅菌します。</li>
		<li>12ウェル培養プレートを、1xポリD-リジンのウェルあたり0.5 mLで、室温で少なくとも1時間または翌日に使用するために一晩治療します。ポリD-リジンの体積が培養領域の底部を完全に覆うのに十分であることを確認してください。</li>
		<li>使用の直前に、培養プレートからポリD-リジンを取り除き、滅菌水で3倍すすいで、細胞をプレートする準備ができるまで滅菌水に入れます。めっき細胞の前に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を除去する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ニューロン成長培地とFACSバッファを準備します。フィルターは滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。ニューロン成長培地は約2 wksのために保つことができます。FACS バッファは約 4 wk のために保つことができます。</li>
</ol>2. 胚海馬の解剖
注:この手順は、海馬の髄液および微細解剖の除去のためのステレオ顕微鏡の使用を必要とするため、ベンチトップで行うことができます。潜在的な汚染を最小限に抑えるために厳格な無菌技術に従います。
<ol><li>CO2チャンバーの胚性18日目に、時を超えた妊娠C57BL/6Jメスマウスを安楽死させる。</li>
	<li>腹部の皮膚と毛皮に70%のEtOHをスプレーし、組織鉗子で皮膚をつまみ、外科用ハサミで小さな切開を行います。腹部を切開して内臓と子宮を露出させる。</li>
	<li>標準的なパターン鉗子で子宮をつかみ、空洞から持ち上げ、細かいはさみでメソムトリウムへの接続を切断します。胚を含む子宮を氷の上に置かれた100mmの無菌プラスチック培養皿に移す。</li>
	<li>細かいはさみと細かい鉗子を使用して、慎重に子宮を切断し、胚嚢を取り除いて胚を放出する。氷の上に置かれたdPBSを含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に胚を移す。</li>
	<li>細かいはさみを使用して胚の子犬を切断し、氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に頭を移す。</li>
	<li>脳を取り除くために、片手に細かい鉗子を持って頭を持つ。一方、湾曲したデュモン#7鉗子を使用して、頭蓋骨の基部に鉗子の先端を挿入し、脳を突き刺すことなく、正中線に沿って前に動く骨と上の皮膚をつまみます。</li>
	<li>湾曲した鉗子を使用すると、皮膚と頭蓋骨を引き離して脳を露出させます。露出した嗅球から小脳まで脳の下の湾曲した鉗子を掃いて、頭蓋骨から脳を持ち上げます。氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100ミリメートルの無菌プラスチック培養皿に脳を移す。各脳について繰り返します。 注: 実験に特化した目的で別々にする必要がない限り、すべての脳を単一の培養皿に集めてもよい。</li>
	<li>ステレオ解剖顕微鏡の下で、一度に1つの脳と2組の無菌デュモン#5鉗子で働き、嗅球をつまんで髄を引き離します。髄液の徹底除去は、他の細胞による培養汚染を避け、さらなる解剖を可能にするために必要である。</li>
	<li>髄液が適切に除去されると、皮質の上側が横に開き、海馬を露出させる。デュモン#5鉗子を使用して、付属の皮質から海馬をつまみ、氷の上に5mLのHibernate-E培地を含む無菌15 mL円錐管に隔離された海馬を慎重に移す。</li>
	<li>各胚性マウスの子犬の両方の脳半球の解剖を繰り返し、実験固有の目的のために別々に必要でない限り、すべての海馬を単一の15 mL円錐形チューブに組み合わせる。<ol>
<li>皮質ニューロンを培養するために、皮質は皮質下皮質から分離され、海馬ニューロンと同じように処理され得る。 注: この時点で、プロトコルが一時停止する可能性があります。B27を補充したハイベルネートE培地の脳または解剖カバピを保存する(2%)4 °Cで最大1ヶ月間、延長遅延は生存細胞の数を損なう可能性がある。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 海馬ニューロンの解離と培養
注:すべての手順は、組織培養指定バイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行われるべきです。
<ol><li>海馬解離のために胚当たり0.5mLのパパイン解離液を調製する。解離に必要な解離液の量は、解剖される胚脳の数によって異なります。 注:皮質ニューロン培養の場合、1胚あたり1.0 mLのパパイン溶液を調製してください。<ol>
<li>ハイバネートE培地の1mL当たり20μLのパパイン懸濁液を約3分間ボルテックスで溶解します。</li>
		<li>パパインが溶解した後、溶液の1 mLあたり1μLのDNase Iを加えます。これは酵素を失活させることができるので、DNase Iが添加された後に溶液を渦出しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離機15 mL海馬組織を含む円錐管(ステップ2.10)で1,000xgで5分間。 上清を取り除き、パパイン溶液を加えます。数回反転して組織を再中断します。37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに組織を再懸濁させる。<ol>
<li>皮質ニューロンを培養する場合は、すべての皮質を新しい100mm滅菌培養皿に移し、プレートから慎重に吸引し、細かいはさみやカミソリの刃を持つミンチ組織を作ります。培養皿にパパイン溶液を加え、無菌移動ピペットを用いて15 mL円錐管にパパイン溶液を用いて皮質組織を移管する。37°Cで30分間、組織と酵素溶液をインキュベートし、10分ごとに攪拌する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>30分間のインキュベーション中に、3つの火で磨かれたガラスのパスツールピペットを準備してください:1完全に開いて、1半分開いて、そして1四分の一開き。</li>
	<li>30分インキュベーション後、消化された脳組織を含む15 mL円錐管を10分間 125xg で遠心分離する。酵素溶液を取り除き、新鮮なハイベルネートE培地の等量に置き換えます。</li>
	<li>完全に開いたパスツールピペットを使用して、組織を10倍にトリチュレートする。組織を2分間落ち着かせ、その後、上清細胞懸濁液を滅菌50 mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。</li>
	<li>半分開いたパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前工程と同じ50mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。</li>
	<li>四半期オープンパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前のステップと同じ50 mL円錐形に再び移します。解ciaしていない残りの組織を捨てます。</li>
	<li>遠心分離機は、細胞懸濁液からの上清を含む50mLの円錐管を 125xg で5分間用いた。まだ行われていない場合は、滅菌水でポリD-リジンコーティングされたプレートを洗浄し、遠心分離中に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を取り除きます。</li>
	<li>遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットをニューロン成長培地の5 mLで再懸濁します。トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して生細胞を数えます。<ol>
<li>皮質ニューロンを培養する場合, 少ない密度の細胞とより正確なカウントのためのニューロン成長培地の少なくとも 10 mL を追加.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ニューロン成長培地を用いた細胞を希釈し、1ml当たり5 x 105個の生存細胞の最終的なめっき密度を実現し、12ウェルプレートの各ウェルに希釈細胞懸濁液1mLを加えます。5%CO2で37°Cでニューロンを維持する。 注:典型的には、1胚マウス脳からの海馬、すなわち、2海馬は、約1 x 106 生存細胞を生み出す。この数値は実験計画目的でのみ提供され、各培養のセル数の代替と見なされるべきではありません。</li>
	<li>培養後の翌日に培養後の培地の半分を取り除き、すなわち0.5mL、培養細胞を破壊しないようにウェルの側面に等量の新鮮な培地を加えて培養した。文化の寿命に対して、週2回の半分のメディア変更を完了します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーによるMHCI発現の評価
<ol><li>インターフェロンβ(IFNβ)またはニューロン成長培地中の希釈剤の等量を希釈することによって治療を準備する。培地交換は半量変化となるため、2倍濃縮IFNβで処理培地を用意する。すなわち、12ウェルプレートの3つのウェルを100 U/mLのIFNβで処理し、培地処理コントロール用に200 U/mL IFNβまたは同量のIFNβと等量のIFNβを1.5mL調製する。</li>
	<li>ニューロンの各ウェルから0.5 mLを除去し、各ウェルにIFNβの有無にかかわらず、ニューロン成長培地の0.5 mLを追加します。実験条件およびシグナル最適化に応じて、通常の成長条件(37°C、5%CO2)で6-72時間インキュベートします。</li>
	<li>治療時間の後、すべての培養培地を取り除き、サプリメントを欠いた冷たい神経基底培地(B27、L-グルタミン、ペンストレップ)で1回静かに洗います。</li>
	<li>1 μg/mLのFcブロックを含む非補製の冷たいニューロ基底培地を0.5 mL、各ウェルに1μg/mLの蛍光共役抗MHCI抗体を加えます。4°Cで45分間光から保護。</li>
	<li>抗体含有培地を取り除き、冷たいdPBSで一度丁寧に洗浄してください。各ウェルに0.5 mLの室温酵素フリー細胞解離バッファーを加え、攪拌して細胞を取り除きます。逆組織培養顕微鏡を使用して解離を監視します。</li>
	<li>細胞が培養皿から切り離されたら、各ウェルに0.5mLのFACSバッファーを加え、細胞をトリチュレートして塊を分散させ、各ウェルの総体積を個々の1.7 mLマイクロ遠心分離管に移します。</li>
	<li>遠心分離機 1,000 x g 5分間上清を取り除き、FACSバッファーの100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、各チューブの総体積を96ウェルUボトムプレートの個々のウェルに移します。</li>
	<li>各ウェルに100μLの固定化試薬を加えます。細胞が凝集するのを避けるために数回トリチュレートし、光から保護された室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り外し、FACSバッファの200 μlで再中断します。</li>
	<li>500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り除き、蛍光共役抗NeuN抗体(1:100希釈)を各ウェルに含むパーメアビライズ試薬を100μLで再懸濁します。よく混ぜ、光から保護された室温で20分間揺れ動きます。</li>
	<li>インキュベーション後、500xgで5分間遠心分離機を使用する。上清を取り外し、FACSバッファの100 μLで再中断します。2x を繰り返します。</li>
	<li>最終洗浄後、FACSバッファーで希釈した2%パラホルムアルデヒドの100 μLで細胞を再懸濁します。細胞が凝集するのを防ぐためによく混ぜます。フローサイトメーターで読み取る準備ができるまで、光から保護された4°Cで保管してください。1週間以内に、できるだけ早くサンプルを読んでください。</li>
</ol>5. データの定量化と評価
<ol><li>各蛍光色素の補償制御を測定し、スペクトルの重複を補正します。理想的な補償制御には、染色されていない培養ニューロン、抗MHCIのみで染色され、抗NeuNのみで染色されたニューロンが含まれます。</li>
	<li>可能であれば、各サンプル (少なくとも 10,000) に対して 100,000 個のイベントを記録し、FCS ファイルとして保存します。</li>
	<li>適切な解析ソフトウェアを使用してデータを分析するには、 図1A-C に示すように、NeuN-陽性ニューロンを選択するシーケンシャルゲートを設定します。<ol>
<li>SSC-A (ログ) と FSC-A (線形) をプロットします。細胞集団(P1)にゲートを描画し、細胞の破片を分析から排除します。</li>
		<li>P1細胞集団内で、FSC-H(線形)対FSC-A(線形)をプロットします。単一セルの母集団にゲートを描画します。</li>
		<li>単一セルの母集団内で、SSC-A (ログ) と NeuN (ログ) をプロットします。NeuN陽性集団に、染色されていない細胞またはMHCIのみの染色された細胞をガイドとして使用してゲートを描画します。</li>
		<li>Y軸上でモードに正規化された細胞イベントを用いてMHCI蛍光のヒストグラムをプロットする。染色されていないまたはNeuNのみの染色されたニューロンをガイドとして使用して、水平ゲートを描き、MHCIに陽性のニューロンパーセントを定量化する。</li>
		<li>統計評価およびグラフ描画のために、MHCIに陽性のパーセント細胞と、NeuN陽性集団のMHCIの蛍光強度の中央値(MFI)をエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections.">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Rodent+Cortical,+Hippocampal,+and+Striatal+Neurons.">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、胚性18日目の出生前マウスの子犬からの主要な海馬ニューロンの解剖および培養を記述する。げっ歯類から培養された主要なニューロンの使用は、現代の神経生物学22で開発された最も基本的な方法論の1つである。不死化細胞株はニューロンの特定の側面をモデル化することができるが、腫瘍由来細胞としての性質、定義された軸索を発達させなかったこと、および細胞分裂を継続することは、生体内23における非実在性ニューロンの特性を忠実に再現するかどうか疑問を提起する。一次ニューロンに代わるもう一つの選択肢は、ヒト誘導多能性幹細胞(HiPSC)の使用である。HiPSCを使用する技術、特に患者由来の技術は、近年急速に進歩しています24.しかしながら、細胞株間の変動性、機能的成熟度の欠如、エピジェネティックプロファイル25の違いなど、HiPSCの取り扱いにはまだ限界がある。一次げっ歯類ニューロンの還元モデルを扱うには制限もありますが、培養ニューロンは生体内のニューロンのポストミトティックな性質を保持します。また、マウスに利用可能な広範な分子生物学ツールと遺伝子組み換えは、多くの用途でHiPSCよりも主要なニューロンの使用を好み、マウス研究は実験的な遺伝的システムを失うことなく、より複雑な生体内生物に簡単に翻訳することができます。これらの理由から, 多くの研究者は、主要なげっ歯類のニューロンを使用して、 主要な側面を検証します, ない場合は、バルク, 彼らの研究の.
あるアッセイの場合、ニューロンは脳ex vivoからの分離に続いて直接分析され得る。 これは特に、特定の実験条件に従うことができる、または複数の細胞タイプの相互作用に依存する可能性のある成体マウスを含む実験に対して望ましい。ただし、実行できる分析の種類を制限するいくつかの問題があります。ニューロンは一意に相互接続され、ミエリン26によって包まれているため、成体マウスの脳からニューロンの単一の細胞懸濁液を準備することは技術的に困難です。組織トリアーションの非酵素的方法は、組織を解離して細胞死を引き起こす際には非効率的であり、一方、酵素製剤はしばしば細胞表面抗原27を切断する。さらに、ミエリンは、胚性マウスからはほとんど存在しないが、それは、成人の脳の約20%を含み、そして生細胞の分離および妨げる流れのサイトメトリー分析28を損なう可能性がある。開発された技術の多くは、最終的に細胞質のニューロンを取り除き、主に核29からなる小さな丸みを帯びた細胞体を残す。これは一部の分析では許容されますが、細胞質や細胞外タンパク質の発現を定量化するには適していません。さらに、還元細胞培養システムは、in vivoシステムで頻繁に可能であるよりも短い時間スケールで特定の機械学的な質問をテストすることができます。
また、このプロトコルでは、IFNβを用いてMHCI発現を薬理学的に刺激する方法、およびフローサイトメトリーによる細胞外MHCI発現の定量化を行う方法も記載されている。IFNβによる刺激は、他の実験条件をテストするのに有用な陽性対照であるが、IFNγおよびカイエン酸はまた、ニューロン9、30においてMHCI発現を刺激し得る一方で、テトロドトキシンはMHCI発現14を減少させることにも留意することができる。MHCI発現を検出するための以前の方法は、その場合のハイブリダイゼーションおよび免疫ヒストリシス分析14、15、20、31に依存していた。mRNAベースのアッセイは、その場合のハイブリダイゼーションやqRT-PCRなど、時空間的局在、細胞型特異性、遺伝子転写レベルを決定できますが、これらのアッセイではタンパク質翻訳や原形質膜への輸送を評価することはできません。免疫組織化学およびウェスタンブロット分析は、タンパク質発現の違いおよび潜在的に細胞の局在化を決定できますが、正確に定量することは困難です。さらに、多くのMHCI抗体は複合体の三次構造を認識し、立体構造変化に対して非常に敏感である。このようにパーメアビライゼーションまたは変性状態は、MHCI免疫反応性32の損失をもたらす。ここで示す方法は、MHCIのsitu免疫染色で使用され、抗体を天然の立体構造で認識させ、続いて固定およびパーメアビライゼーション法を使用します。
わずかな変更を用いて、ここで説明する方法は、他の神経集団を培養したり、関心のある他の細胞外タンパク質の発現を評価するために使用することができる。このプロトコルで注目される、皮質ニューロンを培養するために行うことができる簡単な変更であるが、ここで説明する方法はまた、線条体ニューロン33のような他の神経集団を培養するために使用されてもよい。さらに、このプロトコルはMHCIおよびNeuNの免疫染色を規定しているが、他の細胞マーカーも同様の方法で同定することができる。一般に、細胞外マーカーはMHCIおよび細胞内マーカーのように扱うことができるが、NeuNのように扱うことができる。しかし、細胞解離工程中に、軸索突起はソーマから切断される。ここで定義された格子戦略は、細胞の破片を選別し、神経核マーカーNeuNに焦点を当てているため、軸索突起で排他的に発現されるタンパク質は検出されない可能性があります。
最近まで、ニューロンは、細胞傷害性CD8+T 細胞9に従事するために損傷、感染、またはインビトロサイトカイン刺激に応答するだけでMHCIを発現すると考えられていた。新しい研究は、開発中にシナプス接続を調節する際にMHCIの別の機能を解明しました13.ここで説明するプロトコルは、野生型培養ニューロンにおけるMHCI発現を刺激するためにIFNβを使用するが、同様の方法は、特定の仮説をテストするために様々な細胞刺激または遺伝子修飾と共に使用され得る。この方法により、研究者はMHCI発現を調節する分子メカニズムを研究し、これら2つの異なる細胞機能におけるMHCIの二分の役割の理解を深める。

中枢神経系(CNS)はかつて「免疫特権1」と呼ばれる免疫監視を欠いていると考えられていた。この特権は免疫成分の絶対的な欠如に相当するのではなく、免疫病理学に関連する損傷を制限する特殊な規制を意味することが明らかである。実際、CNSと免疫系との間のコミュニケーションは、健康な脳の発達と感染症への応答のために必要な継続的な会話である2,3。
主要な組織適合性複合体クラスI(MHCI)分子は、感染時にCD8+T細胞に抗原ペプチドを提示する機能について最もよく知られている多形および多形の膜貫通タンパク質である4。従来のMHCI複合体は、膜貫通α鎖とβ2マイクログロブリンと呼ばれる細胞外軽鎖から構成されています。α鎖は、プレゼンテーション5のために抗原ペプチドを結合する多形の溝を含む。細胞外膜上でのMHCIの適切な発現は、高親和性ペプチドリガンド5のローディングと共にα鎖およびβ2-ミクログロブリンの適切な折り畳みを確保するために、小胞体における分子シャペロンの協調作用を必要とする。MHCI複合体が組み立てられるのは一度だけ、小胞体から形質膜6にエクスポートされる。ペプチドを含んだMHCI複合体を伴う同結合性T細胞受容体の関与の際、CD8+T細胞は、パーフォリンおよび顆粒体を含むリティック顆粒を放出することによって細胞殺死を仲介するか、または標的細胞膜7上のFas受容体を結合することによってアポトーシスを誘導する。さらに、CD8+T細胞は、ガンマインターフェロン(IFNγ)や腫瘍壊死因子α(TNFα)などのサイトカインを産生し、細胞変性作用を伴わない感染細胞における抗ウイルス機構を活性化することができる8,9。多くの神経刺激性ウイルスの場合、CD8+ T細胞はCNS10、11、12から感染をクリアする必要があります。
ニューロンは、損傷、ウイルス感染、またはインビトロサイトカイン刺激の条件下でのみMHCIを発現すると以前考えられていた。近年、研究はシナプスリモデリングおよび可塑性13,14におけるMHCIの神経発現に対する役割を同定した。シナプス調節の基礎となる正確なメカニズムはよく理解されていないが、データはMHCI発現レベルがシナプス活性15、16によって調節されることを示す。一つの仮説は、ニューロンが対の免疫グロブリン様受容体B(PirB)を予離的に発現することを示唆し、これはMHCIを経経的に結合する13,17である。この相互作用は、シナプスリモデリングに関与する経路に反対するPirBによるシグナル伝達カスケードを開始し、シナプス接続17、18、19を強化および安定化させる。神経活性がない場合、MHCI発現は14減少し、MHCIの消失はシナプスの消失不良と誤ったシナプス回路20,21をもたらす。
ここで説明したアッセイは、シュヴァリエら9から適応したもので、フローサイトメトリック分析を用いて、マウス海馬ニューロンの一次培養物に対するMHCIの細胞外タンパク質発現を定量的に評価する。このプロトコルは、胚性マウスの子犬から海馬組織をマイクロディスセクトするための初期技術を示している。次に、組織を単一細胞懸濁液に酵素的および機械的に解離するプロセスと、培養をインビトロで維持するための方法について詳述する。 分裂しないため、培養後、ニューロンは実験エンドポイントに適した皿と密度にメッキする必要があります。次に、βインターフェロン(IFNβ)によるMHCI発現を誘導するステップ、MHCIおよび神経核マーカーNeuNの免疫標識、およびフローサイトメトリーによる細胞の分析を行うためのステップを概説する。最後に、MHCI陽性ニューロンを同定し、MHCI発現のレベルを定量化するためのフローサイトメトリーデータを評価する手順について説明する。また、このプロトコルで注目されているのは、海馬ニューロンに加えて、または代わりに皮質ニューロンを培養するために行うことができる小さな調整である。このプロトコルは、遺伝的変異または薬理学的治療を用いて特定の仮説をテストするために容易に変更することができる。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>100 mm sterile culture dish</td><td>Fisher</td><td>FB012924</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Genesee</td><td>21-103</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Genesee</td><td>21-108</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>FACS Buffer Reagent</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP82031Gal</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>96 well U-bottom plate</td><td>Genesee</td><td>25-221</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Borate Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>28341</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td><td>Fisher</td><td>13 678 20C</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Buffer</td><td>Gibco</td><td>13 151 014</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo</td><td>90083</td><td>Dissociation Solution Reagent</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-235</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td><td>Invitrogen</td><td>GAS003</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>Gibco</td><td>A1247601</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td><td>Fisher</td><td>181254</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Interferon Beta</td><td>PBL Assay Science</td><td>12405-1</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td><td>MilliporeSigma</td><td>FCMAB317PE</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Neurobasal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td><td>BioLegend</td><td>116513</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Papain Solution</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>Dissociation Solution Reagent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Stereo dissection microscope</td><td>Swift</td><td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-10</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Corning</td><td>357575</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>101319</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154-100ML</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr></tbody></table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

増加する証拠は、神経免疫相互作用がホメオスタティックおよび病理状態の神経系機能に影響を与えるという仮説を裏付ける。主要な組織適合性複合体クラスI(MHCI)の十分に研究された機能は、特に感染に応答して、適応免疫系への細胞由来ペプチドの提示である。最近では、ニューロン上のMHCI分子の発現が、正常な発達および神経障害の間のシナプス結合性における活性依存性の変化を調節できることが示されている。脳の健康にこれらの機能の重要性は、ニューロンのMHCI発現を容易に検出する高感度アッセイの必要性をサポートしています。ここでは、マウス海馬ニューロンの一次培養法と、フローサイトメトリック解析によるMHCI発現評価の方法について説明する。マウス海馬は、胚性18日目に出生前マウスの子犬から微小化される。組織は、酵素的および機械的手法を用いて単一細胞懸濁液に解離され、次いで非神経細胞の増殖を制限する無血清培地で培養される。インビトロで7日後、MHCI発現は、βインターフェロンで薬理学的に培養細胞を処理することによって刺激される。MHCI分子は蛍光タグ付き抗体をその時に標識し、次いで細胞が非酵素的に単一細胞懸濁液に解離される。神経細胞の同一性を確認するために、細胞はパラホルムアルデヒドで固定され、透過し、ニューロン核抗原NeuNを認識する蛍光タグ付き抗体で標識されます。MHCI発現は、次いで、フローサイトメトリック解析によってニューロン上で定量化される。神経細胞培養は、特定の仮説をテストするための遺伝子組み換えまたは薬理学的介入によって容易に操作することができる。わずかな変更を加えれば、これらの方法は、他の神経集団を培養したり、関心のある他のタンパク質の発現を評価するために使用することができる。

ここで提示された手順を用いて、海馬組織は胚18日目に出生前マウスの子犬から解剖された。組織を酵素的および機械的方法を用いて単一細胞懸濁液に解光し、次いでポリD-リジンで前処理した12のウェルプレートで培養した。インビトロで7日後、細胞は、MHCIの発現を刺激した72時間だけ、IFNβまたは培地の100 U/mLで処理した。ニューロンは、単一の細胞懸濁液に非酵素的に解離される前に、MHCIのSituに染色された。ニューロンを固定し、透過し、次にニューロン核マーカーNeuNについて細胞内染色した。サンプルをフローサイトメトリーで評価し、関連ソフトウェアを用いてデータを分析した。ニューロンは、細胞の破片およびダブレットを除外する全事象の逐次的な格言によって同定された(図1A,B)。ニューロンはNeuN陽性によって決定的に同定された(図1C)。NeuN+細胞は、Y軸上のモードに正規化された細胞数とX軸上のMHCI蛍光を用いてヒストグラム上の細胞をプロットすることによって、MHCI陽性性についてさらに分析した。正と負のピークが発散する点でMHCI+ゲートが描画されました (図 1D)。このことから、MHCI染色に陽性のニューロンパーセント(図1E)および中央値蛍光強度(MFI;図1F)が計算された。結果は、MFIが示すように、IFNβ治療がMHCIの細胞外染色に陽性のニューロンの割合と発現レベルを有意に上方制御したことを示している。統計分析とグラフィカル表現は、市販の統計ソフトウェアを使用して行われました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> 図1:代表的な格言戦略とMHCI定量化。 一次海馬ニューロンは、IFNβまたは培地のみの100 U/mLで治療した。72時間後、ニューロンは太平洋ブルー共役MHCI(1μg/mL H2-Kb)で細胞外染色され、次いでPE共役NeuN(1:100希釈)で細胞内標識した。細胞蛍光をフローサイトメトリーで評価し、データを分析した。(A)合計事象はSSC-A(対FSC-A)対FSC-A(線形)としてプロットされ、細胞(P1)は破片を除外するためにゲートされた。(B) P1集団内で、細胞をFSC-H(線形)対FSC-A(線形)としてプロットし、単一細胞集団をゲートした。(C) 単一細胞母集団内で、セルを NeuN-PE (ログ) に対して SSC-A (ログ) にプロットした。NeuN+細胞は、ニューロンを同定するためにゲート付けされた。(D) ニューロンの集団の中で、細胞をx軸上にMHCI-PacBluを持つヒストグラムにプロットし、y軸上で細胞番号をモードに正規化した。MHCI染色に陽性のニューロンの割合を定量化するために水平ゲートを描いた。(E) 培地中のNeuN+細胞のMHCI+パーセントの定量化およびIFNβ処理ニューロンのみ。(F)培地中のNeuN+細胞に対するMHCIの蛍光強度の中央値(MFI)の定量化(黒)およびIFNβ処理(赤)ニューロン。統計的有意性は、非対t検定によって計算された。**,P < 0.01.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">ニューロン成長培地 (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>50mlの場合</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 サプリメント</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1.0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0.5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペニシリンストレプトマイシン</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
			<td>0.5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>神経基底培地</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48.0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FACS バッファー (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>500mlの場合</td>
		</tr>
<tr>
<td>胎児牛血清</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>エドタ</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">パパイン解離解液</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>1mlの場合</td>
		</tr>
<tr>
<td>パパインサスペンション</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0.020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
			<td>2.5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0.001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハイバーネート-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">注:パパイン解離解液の必要量は、解剖される胚脳の数によって異なります。海馬ニューロンの脳あたり0.5 ml、皮質ニューロンの脳あたり1.0 mlを準備します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">注:Hibernate-Eで約3分間、パパイン懸濁液をボルテックスして解離液を調製してください。パパインが完全に溶解した後、DNase Iを加えます。渦を起じないでください。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:メディアとソリューション

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Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

このプロトコルは、胚性マウス脳から一次海馬ニューロンを培養する方法を説明する。培養ニューロンの細胞外表面上の主要な組織適合性複合体クラスIの発現は、次いでフローサイトメトリック解析によって評価される。

フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

assessing-expression-major-histocompatibility-complex-class-i-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K ビュー.  University of North Carolina at Charlotte. このプロトコルは、胚性マウス脳から一次海馬ニューロンを培養する方法を説明する。培養ニューロンの細胞外表面上の主要な組織適合性複合体クラスIの発現は、次いでフローサイトメトリック解析によって評価される。

ビデオ: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

免疫・感染学

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

神経科学

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central nervous system (CNS). However, further optimization of these technologies would benefit from methods allowing rapid and streamline determination of the extent of CNS and cell-specific targeting upon administration of viral vectors or nanoparticles in the body. Here, we present a protocol that takes advantage of the high throughput and multiplexing capabilities of flow cytometry to allow a straightforward quantification of different cell subtypes isolated from mouse brain or spinal cord, namely microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons and endothelial cells. We apply this approach to highlight critical differences between two tissue homogenization methods in terms of cell yield, viability and composition. This could instruct the user to choose the best method depending on the cell type(s) of interest and the specific application. This method is not suited for analysis of anatomical distribution, since the tissue is homogenized to generate a single-cell suspension. However, it allows to work with viable cells and it can be combined with cell-sorting, opening the way for several applications that could expand the repertoire of tools in the hands of the neuroscientist, ranging from establishment of primary cultures derived from pure cell populations, to gene-expression analyses and biochemical or functional assays on well-defined cell subtypes in the context of neurodegenerative diseases, upon pharmacological treatment or gene therapy.

We present a flow cytometry method to identify simultaneously different cell types retrieved from mouse brain or spinal cord. This method could be exploited to isolate or characterize pure cell populations in neurodegenerative diseases or to quantify the extent of cell targeting upon in vivo administration of viral vectors or nanoparticles.

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

医学

フローサイトメトリーを用いたマウス脳ヒストン修飾定量

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

著者スポットライト:遺伝子発現制御研究の強化

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

要約

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虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化