動脈瘤高脂血症マウスモデルにおけるオイルレッドO染色全大動脈病変のイメージングと解析

apoEおよび他のタイプの高脂血症マウスにおけるアテローム性動脈硬化病変の定量化は、様々な遺伝的要因および新しい治療法の評価の鍵である。我々のプロトコルは、単一のマウスにおける定性的および定量的方法でアテローム性動脈硬化負荷を分析するための段階的な指示を提供する。アテローム性動脈硬化症を誘発してから16週間後、心臓を灌流する前に、10ミリリットルのシリンジに10ミリリットルのDPBSを装填し、25ゲージの針を取り付ける。

実験マウスの腹部皮膚をピンセットで持ち上げ、細かいハサミを使って腹部の付け根から首のてっぺんまで皮膚を切った。胸郭の下の腹壁を開き、ピンセットを使用して胸骨を持ち上げ、横隔膜にアクセスします。横隔膜を切断し、胸郭を切り取って胸腔を露出させる。

次に、心臓の右心房に小さな切開を行い、DPBSの全体積を頂端左心室穿刺にゆっくりと注入する。肝臓と腎臓は淡褐色に変わります。すべての生理食塩水が灌流されたら、不織布のスポンジを使用して胸腔を無関係な血液や体液からきれいにします。

胸腔を拭いた後、非実験臓器を取り除き、ピンセットと細かいはさみで鎖骨を切ってください。マウスを実体顕微鏡の下に置き、ピンセットとスプリングハサミを使用して大動脈を解剖します。大動脈が単離されたら、生理食塩水浸漬不織布スポンジで組織を覆い、上頭症、頸動脈、鎖骨下、腎、総腸骨、大腿動脈を含む大動脈枝を解剖する。

大動脈から分岐する動脈がすべて分離されたら、ピンセットとスプリングハサミを使用して、大動脈と大動脈枝の周りの外側脂肪と結合組織を慎重に解剖して除去します。大動脈と大動脈枝の分離を成功させるには、練習と忍耐が必要です。血管樹を固定するには、まず10ミリリットルのシリンジに4%ホルムアルデヒドを1X DPBSに装填し、25ゲージの針を取り付けます。

ヒュームフードの中に常に4%ホルムアルデヒドを準備することを忘れないでください。根尖左心室穿刺に針を挿入し、固定液の全量をゆっくりと注入する。デモンストレーションのように不織布スポンジで無関係な液体の胸腔をきれいにし、ピンセットとマイクロ解剖スプリングハサミを使用して心臓を大動脈から分離します。

組織が分離されたら、大動脈とその主要血管を頸動脈の1ミリメートル上から大腿動脈の端まで分離して切除し、DPBSの容器に入れます。未開封の大動脈全体をオイルレッドO染色するには、ミヌティエンピンを使用して容器をワックスペトリ皿に固定し、新鮮なDPBSで容器をすすいでください。新鮮な0.45マイクロメートルの細孔ろ過されたオイルレッドO溶液25ミリリットルを皿に注ぎ、室温で60分間染色する。

組織を60%イソプロパノールで沈め、室温で20分間洗浄する。インキュベーションの最後に、新鮮な蒸留水で容器を3回すすぎ、洗浄ごとに5分間、皿を解剖顕微鏡下に置きます。ピンセットとスプリングハサミを使用して、大動脈周辺の血管周囲脂肪組織をすべて優しく洗浄し、誤った背景オイルレッドO染色を避け、血管を清潔なガラス顕微鏡スライドに移します。

オイルレッドOは、脂質が豊富なプラークを赤色にラベル付けし、非プラーク含有領域を淡い色のままにする。その後、カメラを搭載した光学顕微鏡でデジタル高解像度顕微鏡写真を取得し、できればタグ付き画像ファイル形式で画像を保存します。大動脈組織サンプルのエンフェースマウントのために、容器をワックスシャーレに移し、新鮮なDPBSで組織を覆う。

大動脈弓の頸動脈および鎖骨下動脈および腹部大動脈の腸骨動脈を、分岐の1〜2ミリメートル後に切断する。腎動脈を切断する。次に、マイクロ解剖スプリングハサミを使用して、内湾曲および腸骨動脈に沿って大動脈製剤を縦方向に開き、大動脈弓の3つの枝をより大きな曲率に沿って内側湾曲の基底レベルまで切断する。

次に、Minutienピンを使用して、内腔側を上に向けて伸ばさずに大動脈を皿に対して平らに固定し、新鮮なDPBSで組織を覆います。アポリポタンパク質Eノックアウトマウスと比較して、平滑筋細胞TGF−β−R2ノックアウトアポリポタンパク質Eマウスの大動脈壁は重度のアテローム性動脈硬化症を示し、病変を解剖することを困難にする。さらに、動脈瘤は特に大動脈瘤下方に広範であり、高度なヒト大動脈瘤を高度に連想させる。

ここでは、オイルレッドOで染色した高コレステロール高脂肪食餌TGF−β−R2ノックアウトアポリポタンパク質Eマウス由来の未開封大動脈の代表像が示されている。マウスは、上行動脈瘤および腹部大動脈瘤の両方を発症し、上腕頭症、頸動脈、鎖骨下、腸骨、大腿骨、および腎動脈において観察された加速されたアテローム性動脈硬化病変形成を発症した。このエンフェイスオイルレッドO染色は、TGF−β−R2ノックアウトアポリポタンパク質Eマウス組織の、アポリポタンパク質Eノックアウトマウス群と比較して、重度の動脈瘤肥大および大動脈全体の顕著な伸長を明らかにする。

オイルレッドO染色されたプラークを、偽のバックグラウンドであるオイルレッドO染色された血管周囲脂肪組織と区別できることが重要である。アテローム性動脈硬化プラークは3次元現象である。エンフェイス大動脈2D病変定量後、大動脈根や上頭動脈などのプラークセット解析をお勧めします。

このプロトコルはまた、特定の遺伝的要因、介入、または治療がこれらのモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の進行または退行に影響を及ぼすかどうかを決定するためにも使用され得る。