La quantification des lésions athérosclérotiques chez les souris apoE et d’autres types de souris hyperlipidémiques est essentielle à l’évaluation de divers facteurs génétiques et de nouvelles thérapies. Notre protocole fournit des instructions étape par étape pour l’analyse de la charge athéroscléreuse de manière qualitative et quantitative chez une seule souris. 16 semaines après avoir induit l’athérosclérose, avant de perfuser le cœur, chargez une seringue de 10 millilitres avec 10 millilitres de DPBS et fixez une aiguille de calibre 25.
Soulevez la peau abdominale de la souris expérimentale avec une pince à épiler et utilisez des ciseaux fins pour couper la peau de la base de l’abdomen au sommet du cou. Ouvrez la paroi abdominale sous la cage thoracique et utilisez la pince à épiler pour soulever le sternum afin d’accéder au diaphragme. Coupez le diaphragme et coupez la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique.
Ensuite, faites une petite incision dans l’oreillette droite du cœur et injectez lentement tout le volume de DPBS dans la ponction ventriculaire gauche apicale. Le foie et les reins deviendront brun clair. Lorsque toute la solution saline a été perfusée, utilisez une éponge non tissée pour nettoyer la cavité thoracique de tout sang et liquide étrangers.
Une fois la cavité thoracique essuyée, retirez les organes non expérimentaux et coupez la clavicule avec une pince à épiler et des ciseaux fins. Placez la souris sous un stéréomicroscope et utilisez la pince à épiler et les ciseaux à ressort pour disséquer l’aorte. Lorsque l’aorte a été isolée, recouvrir le tissu d’une éponge non tissée imbibée de solution saline et disséquer les branches aortiques, y compris les artères brachiocéphale, carotide, sous-clavière, rénale, iliaque commune et fémorale.
Lorsque toutes les artères qui se ramifient à partir de l’aorte ont été isolées, utilisez une pince à épiler et des ciseaux à ressort pour disséquer et enlever soigneusement l’adipeux adventice et le tissu conjonctif autour des branches de l’aorte et de l’aorte. Un isolement réussi de l’aorte et des branches aortiques nécessite de la pratique et de la patience. Pour fixer l’arbre vasculaire, chargez d’abord une seringue de 10 millilitres avec 4% de formaldéhyde dans 1X DPBS et fixez une aiguille de calibre 25.
N’oubliez pas de toujours préparer 4% de formaldéhyde à l’intérieur d’une hotte. Insérez l’aiguille dans la ponction ventriculaire gauche apicale et injectez lentement tout le volume de fixateur. Nettoyez la cavité thoracique de tout liquide étranger avec une éponge non tissée comme démontré et utilisez une pince à épiler et des ciseaux à ressort à micro-dissection pour séparer le cœur de l’aorte.
Lorsque les tissus ont été séparés, isolez et excisez l’aorte et son vaisseau principal d’un millimètre au-dessus de l’artère carotide jusqu’à l’extrémité de l’artère fémorale et placez le vaisseau dans un récipient de DPBS. Pour la coloration à l’huile rouge O de l’aorte entière non ouverte, utilisez des broches Minutien pour fixer le récipient sur une boîte de Petri en cire et rincez le récipient avec du DPBS frais. Versez 25 millilitres de solution fraîche d’huile rouge O filtrée par les pores de 0,45 micromètre dans le plat pour une coloration de 60 minutes à température ambiante.
Immergez le tissu avec 60% d’isopropanol pour un lavage de 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, rincez le récipient trois fois avec de l’eau distillée fraîche pendant cinq minutes par lavage et placez le plat sous le microscope à dissection. Utilisez une pince à épiler et des ciseaux à ressort pour nettoyer doucement tout le tissu adipeux périvasculaire autour de l’aorte afin d’éviter toute coloration de faux fond Huile Rouge O et transférer le vaisseau sur une lame de microscope en verre propre.
Oil Red O étiquetera la plaque riche en lipides en rouge, laissant les zones ne contenant pas de plaque de couleur pâle. Ensuite, acquérez des micrographies numériques haute résolution avec un microscope optique équipé d’une caméra et enregistrez les images de préférence au format de fichier image étiqueté. Pour le montage en face de l’échantillon de tissu aortique, transférez le récipient dans une boîte de Petri en cire et recouvrez le tissu de DPBS frais.
Couper les artères carotides et sous-clavières de l’arc aortique et les artères iliaques de l’aorte abdominale un à deux millimètres après les bifurcations. Couper les artères rénales. Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort à micro disséquence pour ouvrir longitudinalement la préparation de l’aorte le long de la courbure interne et des artères iliaques et couper les trois branches de l’arc aortique le long de la plus grande courbure jusqu’au niveau de base de la courbure interne.
Ensuite, utilisez des broches Minutien pour fixer l’aorte à plat contre le plat sans étirer le côté lumineux vers le haut et couvrez le tissu avec du DPBS frais. Par rapport aux souris knockout de l’apolipoprotéine E, les parois aortiques des souris Apolipoprotéine E à cellules musculaires lisses TGF-beta-R2 présentent une athérosclérose sévère, ce qui rend difficile la dissection des lésions. De plus, les anévrismes sont particulièrement étendus sous l’aorte suprarénale, rappelant fortement les anévrismes de l’aorte humaine avancée.
Ici, une image représentative d’une aorte non ouverte d’une souris TGF-bêta-R2 knockout apolipoprotéine E riche en cholestérol et riche en graisses colorée avec de l’huile Rouge O est montrée. La souris a développé à la fois un anévrisme ascendant et un anévrisme de l’aorte abdominale avec formation accélérée de lésions athérosclérotiques observées dans les artères brachiocéphale, carotide, sous-clavière, iliaque, fémorale et rénale. Cette coloration à l’huile rouge O du tissu de souris TGF-beta-R2 knockout apolipoprotein E révèle une hypertrophie anévrismale sévère et un allongement marqué de toute l’aorte par rapport au groupe de souris knockout apolipoprotéine E.
Il est important de pouvoir distinguer les plaques colorées à l’huile Rouge O des faux arrière-plans des tissus adipeux périvasculaires colorés en Huile Rouge O. Les plaques d’athérosclérose sont des phénomènes tridimensionnels. Après la quantification des lésions aortiques 2D du visage, nous recommandons l’analyse de l’ensemble de plaques telles que les racines aortiques et l’artère brachiocéphale.
Ce protocole peut également être utilisé pour décider si un facteur génétique, une intervention ou un traitement particulier affecte la progression ou la régression de l’athérosclérose dans ces modèles.
