この方法は、逆に帯電したポリマーの自己集合体から形成されるナノ粒子である高電解質錯体ミセルの設計、組立、および特徴付けの全経路を記述する。高分子電解質自己集合に関する大きな課題は、運動トラップを回避し、ナノ粒子を特徴付けることです。我々が説明する塩焼鈍技術は、大きさと形状の両方で分散性の低いミセルの再現性のあるアセンブリを可能にし、光散乱、小角X線散乱、電子顕微鏡などの特性評価方法を記述する。
治療用核酸の送達は、ナノメディシンにとって長年の課題です。これらの高分子電解質複合体ミセルは、中性高分子コロナがヌクレアーゼおよび免疫応答からそれらを保護するミセルのコアにそれらを隔離するために、核酸の強い負電荷を利用します。組み立て方法は、あらゆるタイプの荷電ポリマーに適用可能である必要があります。
我々は、いくつかのポリアニオンとポリカシオンでそれらをテストし、特性化方法は、界面活性剤ナノ粒子および他の疎水性駆動システムを含む任意の自己組み立てナノ粒子に適用可能であるべきである。オリゴヌクレオチド溶液を摂氏70度で5分間インキュベートすることから始めます。インキュベーション後、室温で15分間冷却し、核酸を熱的にアニールし、次に20ミリモルを投入した濃度のジブロック共重合体の40マイクロリットルを加える。
溶液をすぐに渦液にし、室温で5分間インキュベートする。塩アニールを行うために、オリゴヌクレオチド溶液に塩化ナトリウム溶液を加え、1モルの最終濃度を最大速度で10秒間ボルテックスします。混合物を室温で10分間インキュベートし、透析カートリッジに装填して進めます。
装填する前に、永久的なマーカーでカートリッジをラベル付けし、少なくとも2分間緩衝液に浸して膜を水和する。反時計回りにねじってキャップを取り外し、ゲルローディングピペットチップを使用してサンプルをロードします。膜を軽く絞って余分な空気を取り除き、キャップを交換します。
カートリッジを1X PBS 0.5モル塩化ナトリウム透析浴槽に入れ、両方の膜が浴に露出して浮遊していることを確認します。24時間後、カートリッジを1X PBSに移し、さらに24時間浸します。最終的な透析の後、槽からカートリッジを取り出し、キャップを取り外し、ピペットチップを入れたゲルでサンプルを取り外してサンプルを回収します。
サンプルを清潔な1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、使用できる状態になるまで冷蔵します。原稿の指示に従ってDLS機器でサンプルを準備し、少なくとも1分間データを取得し、取得時間全体にわたってカウント率が一定であることを確認します。自己相関データを調べます。
長い時間のベースラインは平坦で、自己相関曲線は最小限の散乱で滑らかでなければなりません。データのノイズは、より多くのデータを取得することで改善できます。Irenaを使用してデータの削減と分析を行う場合は、まず、バックグラウンドデータセットにミセルをインポートします。
サンプルと背景を対数スケールでプロットし、サンプルとバックグラウンド比を計算し、高いQ asymptoteを確認します。この Q 範囲の平均比率を計算し、データ操作マクロを使用して、計算された比率で背景をスケーリングします。次に、バックグラウンドの減算信号をQの上にプロットし、元のデータを上書きしないように、新しい名前でデータを保存します。
モデリング マクロを開き、引いた背景データを読み込んでプロットします。高分子電解質複合体ミセル(PCM)の外表面の近似モデルを見つけるには、データ制御で適度なQ範囲への流れを選択し、振動が存在する場合は確実に含めます。モデル コントロールで、最初の散布人口を選択し、その人口が使用中のみのかどうかを確認します。
モデルのサイズ分布を選択し、目的の分布タイプを選択して、フォームファクタを選択します。この例は、ユーザーフォームファクタの下に手動で追加する必要がある柔軟なシリンダーを対象としています。柔軟なシリンダーフォームファクタをダウンロードして追加し、円柱の長さとKuhnの長さに対応するパラメータ1と2の関数名と初期値を入力します。
これらのシリンダーは SAXS で解決できるよりも長いので、シリンダー長さパラメーターは大きな値で固定されます。スケール、平均サイズ、および幅のフィールドに値を入力して、検索の初期パラメータを設定します。次に、[モデルの計算] をクリックして、結果のフォーム ファクターを描画します。
適切なパラメータが見つかったら、適合モデルをクリックして、データに適合する非線形最小二乗を実行します。次に、PCMコア内の個々のポリマーの散乱をモデル化する。データコントロールを調整して、通常は中程度から高い範囲にある過剰な散乱が発生する Q 範囲を選択します。
2 つ目の散布人口を追加し、その人口が使用中のみの人口であることを確認します。モデルの統一レベルを選択し、GDA因子GとRGを調整して、低Qでの過度の散乱を予測しないようにし、カーソル間の適合PBを使用してこれらのパラメータの初期推定値を取得します。フォーム ファクタについては、統一レベル モデルに対して非線形適合を実行します。
回折ピークが存在する場合は、目的のQ範囲の回折ピークの3番目のモデルを追加します。個々の散乱母集団に対して近似適合値が得られたら、3 つすべてを一緒にオンにして、結合した適合を最適化します。最後に、各値が物理的に妥当なままであることを確認し、フォルダ内のストアを選択して適合を保存します。
この手順の結果は、サイズの大きなスケールの範囲にわたって、小角 X 線散乱データを十分に記述する複合モデルである必要があります。このプロトコルは、核酸高分子電解質複合体ミセルまたはPCMの設計、組み立て、および特徴付けに使用された。
動的光散乱データは、短い一本鎖オリゴヌクレオチド中の比較的長いブロックコポリマーから形成された球状PCMについて取得した。自己相関関数は、単一の時間スケールでフラット値に減衰し、repISサイズ分布の単一サイズのピークを生じた。複雑な小さな天使のX線散乱またはSAXS強度スペクトルは、存在する複数の空間相関のモデルを組み合わせることによって正確に適合することができ、多角光散乱を使用して散乱測定を長い長さのスケールに拡張することができます。
また、様々な形態のPCMを電子顕微鏡で画像化して、コア半径と形状がSAXSデータのフィッティングから得られた値と一致していることを確認することもできます。SAXS データを適合させる場合は、各スキャッタリング機能を考慮し、TEM のような無料の方法を使用して、正しいフォーム ファクタを使用していることを確認することが重要です。
