組織や小器官の形態の変化を定量化する能力は、遺伝子機能と遺伝子変異の影響を理解するために重要です。私たちのプロトコルは、線虫、C.elegansのシナプス、筋肉、ミトコンドリアの形態を非主観的に評価するために自由に利用可能なソフトウェアを使用する方法を説明します。多くの以前の研究は、形態学的変化を比較するための定性的な方法に依存してきました。
しかし、これらは微妙な表現の違いを捉えない可能性があり、変化を過度に過小評価して過小評価する可能性があり、主観的に評価されるため、問題になる可能性があります。当社の定量的手法は、形態変化を評価するためのより堅牢で偏った手段を提供します。これらの方法は、遺伝子機能と疾患関連突然変異の結果を定義するために、他の細胞構造またはモデル生物の形態学的変化を研究するために容易に使用することができる。
まず、イメージング用のスライドを準備します。溶かしたアガロースを顕微鏡スライドに落とし、すぐに別の顕微鏡スライドで液滴を押し下げ、アガロースを静かに平らにします。アガロースを1分間乾燥させ、2つのスライドを慎重に分離し、スライドの1つに固めたパッドを残します。
顕微鏡ステージにスライドを置き、アガロースパッドの中央に麻酔薬の5〜10ミリリットルの滴を追加します。熱殺菌されたピックを使用して、溶液が乾燥する前にストックプレートから麻酔液滴に10〜15匹の動物を素早く移します。その後、アガロースパッドのすぐ上に置いて、静かに落とすことによってカバースリップを適用します。
488および552ナノメートルの光学ポンプセミ導体ダイオードレーザーに結合され、画像キャプチャソフトウェアを備えた線走査共焦点顕微鏡でシナプス領域を画像化します。ワームを見つけ、40倍に切り替え、浸漬媒体を塗布します。552ナノメートルレーザー、tagRFPフルオロフォアの1%パワー、488ナノメートル、GFPフルオロフォアの2%パワーで蛍光体を励起することにより、シナプス領域を視覚化します。
ハイブリッド光検出器を使用して画像をキャプチャし、フルオロフォアの過度の露出を防ぐためにゲインを設定します。Zスタック画像を収集し、目的に応じて最適なZステップサイズを使用してシナプス全体をカバーします。シナプス領域を分析するには、まず、CellProfiler 3.1.5 ソフトウェアにイメージをロードします。
NameAndType モジュールをセットアップし、UIS-115 トランスジーンから表された拡散タグRFP を使用して、手定義でシナプス領域を決定します。パイプラインに MeasureObjectSizeShape モジュールとメジャーオブジェクト強度モジュールを追加して、手定義のシナプスのサイズと蛍光を測定します。次に、CalculateMathモジュールを追加し、JSIS37から得られた積分強度ユニットをUIS-115から得られたもので割ることによって、相対的な集積蛍光強度を計算します。
すべての測定値と計算をエクスポートが完了した場合。筋肉細胞の領域を測定するには、フィジーのソフトウェアで画像を開き、ポリゴン選択を使用して、単一の斜めの筋肉細胞の周りを慎重にトレースします。アンカー ドットをドラッグして、最後のポリゴンのラインを調整してトレースを改善します。
ソフトウェアの上部にある [分析] タブに移動し、[測定] をクリックして、選択した領域を計算します。退化または欠落した領域を持つ筋肉細胞の場合、ポリゴン選択ツールで欠落領域をトレースし、もう一度[測定]をクリックします。複数のギャップがある場合は、それぞれを別々にトレースします。
セル全体の面積に対するギャップ領域の比率を計算します。比率が高い場合は、筋肉変性の程度が高いことを示します。また、不足している領域がない場合、比率はゼロとして計算されます。
エラスティックを開き、[新しいプロジェクトの作成] で [ピクセル分類] を選択します。その後、プロジェクトの名前を変更して保存します。[入力データ] タブに移動し、[新規追加] をクリックし、[別のイメージを追加] をクリックします。
ポップアップ ウィンドウを TIF ファイルのあるフォルダに移動し、目的の画像を選択します。[機能の選択] タブで[フィーチャの選択]をクリックし、緑色のチェックボックスで示されたすべてのピクセル フィーチャを選択します。このステップで選択するピクセルは、次のステップでピクセルのクラスを区別するために使用されます。
トレーニングパネルを使用して、個々のGFP発現ミオシンフィラメントと不要な背景を区別します。ラベルを追加をクリックし、フィラメント間の不要な背景とスペースをスクロールして、分類器のトレーニングを開始します。2つ目のラベルを追加し、フィラメントに名前を変更し、多数のフィラメントをスクロールします。
[Live Update] をクリックして、分類が正しく行われていることを確認します。必要に応じて、さらにスクロールを追加してトレーニングを微調整します。トレーニング分類が実行されたら、[予測エクスポート]パネルに移動し、[確率をソースとしてエクスポート画像設定を選択]をクリックします。
切り抜きサブ領域 x と y にチェックが付いて、c がチェックされていないかどうかを確認します。c の開始値と終了値としてゼロと 1 を選択し、データ型を符号なし 8 ビットに変換します。[再正規化] にチェックマークを付けて、出力ファイルのビデオを png に変更し、必要に応じてファイルとディレクトリの名前を変更します。
エクスポート設定ウィンドウを閉じ、セグメント化されたイメージをエクスポートします。その後、フィジーのソフトウェアでpngファイルを開きます。デフォルト設定を使用してイメージのしきい値を調整し、スケルトン化プラグインを適用すると、別の結果表が作成されます。
このプロトコルは、シナプス開発におけるα-チューブリンアセチルトランスセリアーゼMEC-17の機能を探求するために使用されてきた。後部/横方向微小管またはPLMシナプスの画像の定量分析は、MEC-17の過剰発現が正常なニューロン機能を破壊することを示す。MEC-17を過剰発現する野生型制御動物と比較して、シナプス前領域およびシナプス完全性が有意に低下している。
これらの技術は、CMT2関連遺伝子の突然変異を運ぶシャルコー・マリー・トゥース2またはCMT2のC.elegansモデルを分析するためにも使用されています。体壁筋形態の視覚的評価は、野生型制御と比較して試験動物の欠損の2.5〜3.5倍の増加を明らかにした。fzo-1およびunc-116の突然変異を有する動物は、筋線条化、細胞の破片の蓄積、および筋線維変性の喪失を経験した。
dyn-1の突然変異を有する動物は筋肉形態の欠陥が有意に少なかった。fzo-1およびunc-116変異体は、全単細胞領域に対するギャップの比率が5〜6倍増加し、野生型動物と比較して平均繊維長が劇的に短くなった。サンプル間での比較を行うためには、画像取得に最適な条件を決定し、これらの条件が一貫して使用されるようにすることが重要です。
これらの技術は、研究者が定量的アプローチと異なる遺伝的背景間の形態学的変化を比較することを可能にする。これにより、主観性が低下するため、生成されるデータの表現性を高めることができます。
