9-フェナントロル感受性カチオン電流の特性評価のための新たに分離されたヒトデトルサトール平滑筋細胞の調製と利用

デトルス平滑筋細胞は尿膀胱の壁を形成し、最終的には尿の空隙と貯蔵を容易にする。当社のプロトコルは、単一の平滑筋細胞を新たに単離するための検証済みの信頼性の高い方法を提供します。新たに単離されたヒトデトル平滑筋細胞は、単一細胞レベルでの電気生理学的および分子検査の機会を提供する。

コントロール、正常、および病気のヒト尿膀胱から単一のデトルサの平滑筋細胞を研究することにより、我々はイオンチャネルなどの薬理学的標的を検証する機会を有する。単一ヒトデトルストル平滑筋細胞は、パッチクランプ電気生理学などの電気生理学的実験に最適です。ここでは、非選択的なカチオンチャネルであるTRPM4、一過性受容体電位メラストタチン4チャネルという単一のイオンチャネルを研究する例を紹介する。

初心者は、新しい単離されたDSM細胞を得るための重要な重要なステップを認識するなど、効率と精通性を必要とする解剖および酵素治療ステップに苦労する可能性があります。ヒト膀胱の神学に精通していることが重要であり、単一細胞を単一の細胞を単離するためのプロトコルステップは弾力性を保ち、最初はこのプロトコルを使用して最適でない細胞を得ることを期待する。全体の厚さの尿膀胱標本を調べることから始めます。

標本をピン留めし、上向きの粘膜をシリコーンエナタイオマーコーティングされた150mmの丸皿に下ろし、鋭い解剖によって慎重にすべての粘膜を取り除きます。いくつかの粘膜フリーのデトルッサの平滑筋またはDSM片を切り取る。パパインとジチオトレイトール、またはDS-Pを含む事前に温められたDSの1〜2ミリリットルのチューブに3〜6個のDSMピースを入れる。

30~45分間摂氏37度でインキュベートし、10~15分ごとにチューブを振るようにします。インキュベーション後、チューブからDS-Pを取り出し、DSM片を氷冷DSで短時間洗います。DSMピースを付けたDSを新しいチューブに移し、DSを取り外し、DSMピースをチューブの底に残します。コラゲターゼII型(DS-C)を含むDSの1〜2ミリリットルをチューブに加えます。

そして、時折揺れで摂氏37度でそれをインキュベートします。DS-Cを捨て、酵素処理されたDSM片を氷冷DSで5~10回洗います。最後の洗浄の後、チューブ内のDSを残し、単一のDSM細胞を放出するために、火で磨かれたパスツールピペットで作品を穏やかにトリチュレートします。ピペット0.25〜1ミリリットルの細胞懸濁液を、反転顕微鏡のステージに座っているガラス底チャンバーに、少なくとも45分間インキュベートして細胞が付着できるようにします。

その後、浴からDSを取り出し、重ね合わしてE溶液に交換します。複数のパッチ電極を引っ張り、電極先端を火で磨き、必要に応じて先端を歯科用ワックスでコーティングします。溶液中に電極を短時間浸して、アンホテリシンBを使わないピペット溶液でパッチ電極の先端を充填します。

パッチクランプ電気生理学の成功は、DSM細胞の品質とアンホテリシン-Bの可溶化に依存します。アンホテリシンBを含む同じピペット溶液を電極にバックフィルし、パッチクランプアンプヘッドステージに接続されたホルダーに電極を取り付けます。電極の先端が水没するように、マイクロマニピュレーターを使用して電極を細胞外溶液の表面のすぐ下に配置します。

そして、市販品取得ソフトウェアの膜試験窓機能を用いて電極抵抗を求め、目的のセルに向けて電極を前進させる。電極でセル表面に触れるときは、管を介して電極に穏やかな急速な負圧を印加してギガシールを形成する。これにより、電極の先端に負圧が発生し、膜試験で確認されたギガシールが成功します。

アンホテリシンBがピペットを拡散させ、原形質膜に挿入し、主に1価カチオンに選択的に細孔を形成するまで30〜60分を要する。膜試験機能でギガシールのモニタリングを続けます。パッチの穿径が最適な場合は、セルの容量のダイヤルとアンプの直列抵抗を調整して、キャパシタンストランジェントを取り消します。

安定した電圧ステップのカチオン電流が観測されたら、原稿に記載されているように、ルーティング電圧ステッププロトコルで電流を記録します。化合物または生理学的試験条件を適用して、過合による試験を行い、洗浄と同様に制御条件および試験条件に対する応答を記録します。このプロトコルは、機能的および分子的研究のために健康で新鮮なDSM細胞を分離するために使用することができます。

健康な単一のDSM細胞は、スピンドル状の形態、鮮明な明確な縁、細胞の周りの明確に定義されたハロー、および顕微鏡下で見たときに半収縮の外観によって特徴付けられます。さらに、新たに単離されたDSM細胞は、機械的刺激およびカルバコールに反応する。細胞断片および非生存細胞または過剰消化細胞は、後続のパッチクランプ実験では避けるべきである。

この単離細胞は、3つの異なるヒトDSM細胞において電圧ステップ誘導またはランププロトコルのいずれかで全細胞電流を測定したアンホテリシンB穿刺パッチクランプ実験で使用されている。実験は、9-フェナントロル、TRPM4チャネル阻害剤が効果的かつ可逆的にヒトDSMカチオン電流を阻害することを明らかにした。9フェナントロール感受性電流成分は、正の電圧および外向きの整流においてより強い阻害を示す。

酵素処理ステップの条件は、温度、酵素処理の持続時間、酵素ロット源およびDSM細胞の品質を含むステップ2.2および2.3が、高品質のヒトDSM細胞を得るための重要な決定因子である。また、ヒトDSM細胞は、カルシウムや環状AMPなどの細胞内第二のメッセンジャーレベルの評価、免疫細胞化学によるタンパク質発現の検出、その際の近位訴訟アッセイによる共発現、RT-PCR、qRT-PCR、マイクロアレイ、次世代シーケンシングによるmRNA発現にも最適です。ヒトDSM細胞は、尿膀胱におけるBK、カルシウム、TRPM4チャネルの役割についての理解を進めています。

今後の開発により、電気生理学的または薬理学的特性をトランスクリプトームまたはプロテオームプロファイルと特異的に結び付ける。