この研究は、LBにNIH R37 DK54824およびR01 DK57284助成金によってサポートされていました

ここで説明するすべての手順は、ピッツバーグ大学のIACUC委員会により承認されています。 1。ソリューション<ol><li>レシピに従ってKrebs溶液を調製します。 mM単位組成：NaClの118、塩化カリウム4.7、 塩化カルシウム1.9、 硫酸マグネシウム1.2、 炭酸水素ナトリウム24.9、KH 2 PO 4 1.2、ブドウ糖11.7。 </li><li> 95％O 2、5％CO 2で曝気クレブスを、実験全体にわたって使用される37ºC水浴中に置き。脇に置く〜室温で曝気クレブス溶液200mlを組織切開に使用する。 </li><li>曝気クレブスのpH（〜7.4）と、浸透圧（〜300 mOsmで）を測定します。 </li></ol> 2。実験セットアップ（回路図図1A） <ol><li> （95％O 2、5％CO 2）を10mlのクレブスとチャンバー曝気埋める。 </li><li> 37℃にチャンバを加熱する循環水ポンプを始動;アンプ（S）、刺激剤（：必要な機器の電源を入れるs）とレコーディングソフトウェア。 </li><li> 1グラムの重量を有する変換器を校正します。 </li></ol> 3組織（図1B） ：以下の手順に従って、大人のナイーブな女性のSprague Dawleyラット（〜10〜12週齢200〜250グラム）から膀胱を削除する<ol><li>解剖エリアと必要な器具の準備：電気カミソリ、歯鉗子、メスの刃、解剖ハサミ、microscissorsを、2解剖鉗子は、組織·クリップ（または絹縫合糸）、クレブスとしたシルガードコーティングされた解剖皿（著者は、デュモン鉗子＃3を好む）組織切開端子です。 </li><li>誘導チャンバー内のイソフルラン吸入（O 2中4％）で動物を麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。継続的に反射を撤回呼吸数、外部刺激に応答して、リア四肢の喪失を観察することによって、麻酔のレベルを監視します。 </li><li>動物は、ひげをそる下腹部A麻酔をされた場合レア。腹部正中切開により骨盤臓器を公開します。膀胱と尿道を特定します。近位尿道の近くに膀胱頸部で切断することにより、膀胱を削除します。曝気クレブス溶液で満たされたシルガードコーティングされた皿に、すぐに組織を置きます。 </li><li>必要であれば、この時点で追加の組織を除去する：尿道、胃腸（GI）管および/ ​​または前立腺の断片など </li><li> IACUC承認された方法（ 例えば 、麻酔薬の過剰投与または二次の方法に続いてCO 2窒息）を用いて動物を生け贄に捧げる。 </li><li>さらに解剖のための組織を安定させるために、膀胱ドーム、首、尿管を通って組織切開のピンを挿入します。組織を伸ばさない。存在する場合、脂肪、結合組織、近位尿道および尿管を取り外します。 </li><li>平坦なシートを作成するためにドームにベースから膀胱を開き、漿膜側を下/腔側アップ（ 図1B）。組織の各コーナーに解剖のピンを配置します。膀胱D​​OMを削除するeと首組織。 </li><li>実験の目的は粘膜（尿路上皮と固有層-ダイアグラム図1Cを参照）の寄与を決定することである場合には、平滑筋収縮をして、添付粘膜ずに排尿筋ストリップの特性を比較。このために、帯状に組織を切断する前に、慎重にアイリスを用いて粘膜層を除去し、ハサミ、解剖顕微鏡下で、微細鉗子を春。実験の最後に、粘膜の完全な除去を確認するために、H＆E染色のためにストリップを固定します。この手順は、ラットの膀胱に比べて、マウスの膀胱内に簡単であることに注意してください。 </li><li> 〜2×8ミリメートル（ 図1B）の短冊状にドームにベースから縦に組織を切断する。接続するか、各ストリップの両端に、組織のクリップを取り付けます。 注：ワンラットの膀胱は、通常は4ストリップに切断することができますが、ストリップの数は、動物/膀胱サイズに応じて増減することができます。 </li><li> EXPERにストリップを転送imental室。固定されたガラス/金属棒に組織収縮を測定する力変換器に各ストリップの一端を取り付け、その他。 注：組織チャンバーのサイズは（20ミリリットル以上0.2 ml）を変化させる。げっ歯類ブラダーのための典型的なチャンバーは完全に溶液中に浸漬するストリップのために十分な高さを提供する5〜20ミリリットルである。一部のチャンバーは、内蔵の刺激電極と他人をしない来る。ケアは、特に電場刺激が信頼できない、電極のすべての接続が良好な状態であることを保証するために注意すべきである。 </li><li>ベースライン張力が1g（〜を10mN）に達するまで穏やかに組織を延伸することによって、各ストリップに力が規定量を適用する。当初は組織は、ベースラインの張力の減少として記録されているリラックスする傾向がある。ウォッシュ暖かい曝気クレブスを用いて組織ごとに約15分であり、各洗浄後に1グラムのベースライン張力を調整すること。 （ベースラインテンションが安定している組織は〜のために1〜2時間まで、または平衡化することを許可するすなわち 、それ以上の組織弛緩）。 </li><li>直接〜5分間浴、またはプラトー応答が到達するまでのKCl（80ミリモル）を添加することにより、試験組織の生存率。 KClを高濃度に応答も実験中または実験の最後に反復し（データ解析部の下に正規化を参照）、他の薬物またはストリップ間の応答を正規化するために使用することができる。 </li><li>組織が前処理条件に戻れるようにする温かい曝気クレブスで洗う組織を複数回（3-5x）。 </li></ol> 4。刺激プロトコル<ol><li>自発的な筋原性活動や平滑筋緊張に対する病理学の影響を調査するために、平滑筋などのSCI、BOOなどの異なる動物モデルからのストリップ、または新生児を使用します。 図2に、開発中に膀胱の自発活動の変化を調査するためにこの方法を使用することを示し、 SCI後。さらに、薬理学的薬剤は、種を調節するために使用され得るontaneous活動。 図3に、自発的な活動と平滑筋の緊 ​​張に、KCNQチャネル調節、フルピルチンとXE991の効果を示す。 </li><li>定義された時間間隔で浴に直接濃縮ストック溶液から化合物を添加することにより薬理平滑筋刺激コンストラクト濃度応答曲線である。車両や時間の影響を考慮するために平行なストリップに薬物および車両を使用してください。 <ol><li> 1000倍の最終使用濃度において所望の試験化合物のストック溶液を作る。 10 -5 M、3×10 -5 M、10 -4 M、3×10 -4 M、10 -3 M、3×10 -3 M：カルバコール（CCH）、ムスカリン性受容体作動薬は、以下のストックを調製、10 -2 M.浴中の最終濃度は10 -5 M（ 図4C、D）を10 -8 Mである。 10 -8 M、10 -7：ニューロメジンB（NMB）、ボンベシン受容体サブタイプ1アゴニストは、以下の株式を準備M、10 -6 M、10 -5 M、10 -4 M、10 -3 Mと浴中の最終濃度である10 -11 M〜10 -6 MのCChとNMB両方は、組織の収縮性を増加することが予想される。 </li><li> 10ミリリットル組織槽の場合は、できるだけ早く応答がプラトー（ 図4C、D）に到達するように、各制御CHのストック溶液10μlを加える。平行なストリップでは車両の等量（水）を追加します。同様に、各ニューロメジンBストック溶液10μl毎〜5分を追加します。 注： 図4の異なる種からのストリップにおける平滑筋緊張に対するNMBとのCChの興奮効果を観察します。 </li><li>興奮剤は、通常のCChまたはKClで予め収縮組織中の平滑筋の弛緩特性を調査します。 </li><li>アゴニスト応答をブロックするには、事前のアゴニスト刺激に対する組織の浸透を、可能にするためにアンタゴニストで10〜20分間、組織を前処理。 </li></ol></li><li>神経stimのためにまた、電場刺激（EFS）と呼ばれる平滑筋のulationは、3.13〜ステップ1に従い、以下に説明するように継続する。 EFSを選択的に平滑筋に対する神経を活性化することを意図している。刺激のパラメータは、慎重に直接平滑筋の刺激を避けるように選択すべきである。 <ol><li>刺激パラメータを確立します。刺激のタイプ（単一パルスまたは電車）、持続時間（パルス持続時間と列持続時間）、頻度と強度は、以下の手順で説明し、 図5A、Bに示すように。 <ol><li>単一パルス刺激は、パルス持続時間、刺激間間隔および所望の刺激の数を設定する。通常の刺激持続時間パラメータは、所望の間隔（ 図5A）で供給0.05〜0.3ミリ秒の持続時間の単一のパルスである。刺激強度に対するステップ4.3.1.4に従ってください。 </li><li>列車の刺激のために、列持続時間およびインタートレイン間隔を設定します。膀胱組織の典型的な値は3〜10秒には、少なくとも1メートルを配信されます離れにある（ 図5B）。組織疲労が（ つまり、EFS収縮が制御期間中に減少）が発生した場合は、インタートレイン間隔を増やします。 </li><li>電車の中で列車の刺激の周波数（パルスの数を確立 - 図5B）。 0.5〜50 Hzの範囲の周波数応答曲線を実行します。膀胱のための典型的な周波数は、ATPとのAChによって仲介再現性のある安定した収縮を与える10-20 Hzである。この方法は、コリン作動性神経伝達にプリンのメカニズムの寄与を評価するために使用できる方法を示す図5のマウスの膀胱ストリップにおけるEFS刺激に対する周波数依存応答を観察します。 </li><li>刺激の強度を確立する：（使用して列車は周波数を一定に保つ場合）収縮の振幅がプラトーに達するまで体系的に刺激の強度（電圧）を増大させる。 </li><li>に応じて刺激の強さを設定実験の目的。目的は、神経誘発収縮を増加させることである場合には、収縮の振幅が最大収縮の約50％であるような準最大強度を使用する。目的は、神経誘発収縮を減少させることである場合は、組織の疲労を回避するために、最大振幅の〜80％に強度を設定する。 </li></ol></li><li>刺激パラメータ（期間、頻度と強度）が確立されると、EFS-のため20〜30分は、薬物検査の前に安定させるために収縮を誘発〜許す。 注：Na +チャネル遮断薬で、神経伝達を遮断、神経伝達のためにEFSの選択性を確認するには、テトロドトキシン（TTX; 0.5〜1μM）。 TTXは、比較的簡単に洗い流すように、実験開始時にこの手順を実行します。また、（ステップ4.3.5を参照してください。下の）実験の最後に、これを実行します。 </li><li>のために1,000倍の最終作業濃度でストック溶液を準備します。アルファ、ベータメチレンATP（ABMA;プリン受容体活性化剤と減感）10 -2 M、アトロピン（ムスカリン受容体拮抗薬）10 -3 M（ 図5C）。図6の他の例を観察する。5HT4受容体アゴニスト、シサプリド（3×10 -6 M、10 -6 Mを、3×10 -5 M、10 -5 M、3×10 -4 Mを、10 -4 M、 3×10 -3 M、10 -3 M）は、組織の収縮およびSB-203186（3×10 -3 M）、5HT4受容体拮抗薬が増加しシサプリドの効果を逆転させる。 </li><li> EFS（ 図5C）にABMAおよびアトロピンの効果を試験するために、2つの制御周波数応答曲線を実行する。 10μMの最終濃度浴に10 -2 M ABMA10μlのを追加します。これは、平滑筋におけるプリン受容体の直接刺激に組織を収縮する。ベースラインへの応答が戻った後、周波数応答曲線を繰り返す。最後のconcentrat 10 -3 Mのアトロピン10μlのを追加1μMのイオン。 （ムスカリン受容体を遮断するアトロピンのために必要）〜10分後、周波数応答曲線を繰り返す。平行なストリップでは、各ステップにおいて、車両、水10μlを加える。 注： 図6の他の例については、定義された時間間隔で、各シサプリドストック溶液10μlを加える（〜15分毎に、説明を参照）、お風呂に直接SB-203186のストック溶液10μlが続き、に対するそれらの効果を監視するEFS誘発収縮。平行なストリップでは車両のDMSO 10μlを加える。シサプリドの効果を観察し、 図6のヒト膀胱と回腸組織におけるEFS誘発収縮に対する5HT4受容体作動薬は、。さらに、ヒト膀胱および回腸組織におけるEFS誘発収縮に対するDMSOの影響、シサプリドのための車両を観察。 </li><li> EFSプロトコルの終わりに、Na +チャネル遮断薬、テトロドトキシン（TTXで神経伝達を遮断することにより、EFSの選択性を検証する。0.5-1＆＃181; M）。 TTX抵抗性の収縮がまだ存在している場合は、その後の実験では、刺激の持続時間と強度を調整することをお勧めします。 </li></ol></li><li>前または後シナプス部位（ 図7A）に対する薬物の効果を測定するために4.3.2ステップ1に従ってください。カルバコールとEFSに再現性のある反応を確立し、その後、薬物Xを追加</li><li>実験の最後に、クリップを取り除くまたはストリップをほどく、余分な液を除去し、天秤を使用して各ストリップの重量を測定するためにティッシュ紙の上にそっとブロット。また、断面積を決定するために、キャリパーを用いて組織の長さを測定する。この情報は、データの正規化のために使用されます（セクション5.4を参照）。 </li></ol> 5。データ解析適切なソフトウェア（ 例えば 、Windaq、LabChartの）を使用してデータを分析します。 <ol><li>自発的活動のために、薬剤誘発性応答のピークの前とで少なくとも30秒のウィンドウを選択してくれASURE振幅と筋原性活動の頻度（ 図3）。 <ol><li>膀胱の異なる部分の間に相違がある応答の収縮性かどうかに寄与する周波数のスペクトルを決定するために、高速フーリエ変換解析を使用して（ 例えば 、首対ドーム）または開発、病理学、および薬8である。 </li></ol></li><li>平滑筋の緊張への影響については前と薬剤誘発性応答のピークで少なくとも10〜30秒のウィンドウを選択し、収縮の振幅を測定。 </li><li>神経誘発収縮に対する効果について（少なくとも3）の前に、薬剤誘発性応答のピーク時に収縮の曲線下振幅、持続時間と面積を測定します。 NOTE：プリン作動性およびコリン作動性の成分が異なる速度を持っているので、EFS誘導性収縮の振幅曲線下面積の両方を測定する必要がある。プリンコンポーネントは迅速かつ一過性である（ATPはpurinergiを活性化させるカルシウムの迅速な流入を可能にするようなP2X1などのCイオンチャネル型チャンネルは、それらは、このように曲線下面積に対するピーク振幅応答に対してより少ない貢献、）脱感作。コリン作動性成分（アセチルコリンが最終的に収縮を誘導するために、平滑筋を脱分極イオンチャネルを活性化する細胞内経路を活性化するために多くの時間を必要とする代謝型ムスカリン受容体を活性化する）遅く、持続的である。このように、ムスカリン性成分は曲線下面積を測定することによって、より良いキャプチャされます。 </li><li>ストリップ及び薬理学的治療を横切っ結果を比較することができるようにデータを正規化する。正規化のために選択されたパラメータは、病理学的状態を研究や実験計画、試験化合物によって影響されるべきではありません。これらのパラメータのうち、利用ストリップの重量、断面積、塩化カリウム応答（ 図4B）、最大応答（ 図7B）の％または別の収縮剤に対する最大応答の％（ 例えば 、のCCh）やリラックス剤（ 例えば 、パパベリン）。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

本論文では、膀胱生理学および病理学に関連する重要な科学的問題の数だけでなく、膀胱機能不全を治療する新薬の発見を助けるに対処するために使用することができ、簡単なin vitroでの平滑筋収縮方法を説明した。私たちは、膀胱平滑筋の収縮（ 図2-4）、神経伝達変調（ 図5-7A）、種差（ 図4）、臓器差（ 図6）、発達病理学的および薬理学的特性を評価するためのこの方法の使用を例示している特定の膀胱のコンポーネントの関連性（ 例えば 、粘膜、 図7B）。ここでは図示していない付加的なアプリケーションには、薬理学的物質3,10,11、各種薬物22-24、または評価/送信機RELEの定量化の構造活性相関を用いた細胞内経路の評価を含める神経刺激25の後アーゼ。 膀胱機能が最終的にインビボで評価することができるが、このインビトロ法は、 インビボで問題となる多くの状況を克服する。これらは、外科的および薬理学的操作は生存率および/ ​​または臓器もしくは動物の生存を減少させるであろう状況で、ヒト組織の使用、特定のコンポーネントからの応答を同定し、特徴付けるための必要性（神経上皮対対例えば 、平滑筋が含まれる）や高価な化学物質の使用。この方法は、平滑筋の収縮活性に対する、よく制御された方法と環境内のさまざまな薬理学的物質だけでなく、病状の影響を系統的に調査することができます。 この方法は、情報の過多を提供します。この情報を解釈し、外挿するときただし、注意が必要です。これは、減少準備のin vitro方法、投あるその通常の環境と神経のコントロールから接続されています。実験条件は、このように、データが完全に生体内の生理的状況では反映されない場合があり、生理的ではありません。例えば、本方法は、血流の変化、ホルモン、体液性物質、外部の機械的な力、または外因性の神経制御を説明できない。組織は、このように損傷および虚血に関連する応答を考慮に評価し、取られる必要がある、急性分散型である。彼らはすでに求心性、平滑筋、粘膜または壁内神経機能（ すなわちセルラー可塑性）を変更した場合を除き、脳や脊髄に生じる病理学的変化は、この方法を使用してテストすることができません。電場刺激（EFS）神経調節性応答を評価することができます。排尿反射は、特定pathwを活性化するin vivoでの状況とは対照的に、しかし、それは、ストリップ（ 例えば 、交感神経、副交感神経、求心性神経）に無差別にすべての神経を励起し、AYS。この状況を克服する1つの方法は、選択的に異なる経路を遮断する特異的アンタゴニストでEFSを組み合わせることである。例えば、収縮特性を研究するグアネチジンはノルエピネフリン放出をブロックするために使用することができ、又はアトロピンの緩和特性を研究する際に膀胱収縮を防止するために、ムスカリン受容体を遮断するために使用することができる。最後に、組織の生存率は、時間の特定の数に限定される。一般的に、膀胱組織のほとんどのコンポーネントは、6〜8時間、またはそれ以上の期間にわたって（ すなわちレスポンスを劣化させることなく、EFSへの対応）生存可能であり、安定している。しかし、他の組織はより敏感である（;著者の個人的な経験などは 、回腸〜6時間以下続く）。 この方法は技術的に可能と再現性よくあるが、その成功を確実にするために必要ないくつかの重要なステップがあります。まず、組織標本は、必要な変更を加えることで、生存率を確実にするために慎重に行うべきである解剖プロシージャに異なる組織タイプまたは種のため、必要に応じておよび/またはメディア（ストリップを準備しながら、組織を伸ばす避ける）。もう一つの重要なステップは、設定アップされている天井効果が回避されるように、神経刺激パラメータを、。方法の項で説明したように、これは、試験化合物の作用の実験を行い、予想されるメカニズムのタイプに依存する。例えば、膀胱細片に、（ 図6）シサプリド、5HT4受容体アゴニストの効果を試験するために、私たちは最大のの〜50％、EFS誘発収縮の振幅を設定。これは、すなわち、次にEFS-誘発収縮を増加すると予想される接合部前副交感神経27からのACh放出を増強する、5HT4受容体アゴニストの作用の公知の機構に基づいていた。神経対筋肉の刺激は、神経伝達を阻害し、したがって、EFS誘発収縮を阻害するはずであるTTXを使用してテストする必要があります。車両とティムのための適切なコントロールeは、時間と組織の劣化や車両のいずれかの可能性のある影響を考慮するために薬物検査中に実行されなければならない。例えば、多くの薬物はDMSOまたはエタノールに溶解する。本発明者らのデータ（ 図6）は、DMSO（0.1％以上）は、試験薬物の効果から減算される必要がある効果を神経的に誘発収縮を増加させることができることを示している。同様に、（1％まで）エタノールが自発的な平滑筋の収縮を低減するが、神経誘発収縮34,35には影響しません。遺伝子操作された動物または外科的モデル（ 例えば 、脊髄損傷または卵巣摘出）を使用している場合、コントロールはそれぞれ、適切なバックグラウンドマウス株または偽手術動物由来の組織を含める必要があります。また、例えば、ヒト、マウスおよびモルモットの膀胱のようないくつかの組織は、壁内神経節を含んでいる。これらの組織で作業する場合、プロトコル選択とデータ解釈は、学内NEの薬物やEFSのアカウントの影響を考慮する必要がありますさらに平滑筋を刺激urons。 、実験プロトコルの設計、試験される（薬物刺激のため、EFSのために）正しいパラメータを選択し、濃度が意味のあるデータを確実にするために重要である。パラメータは、個別の組織や麻薬のために調整されるべきであるが、以下に概説する一般的な原則/ガイドラインが適用されます。累積濃度応答曲線が望ましいが、これは全ての化合物は不可能である。このような組織（例ACH）で迅速に代謝されるpurinericイオンチャネル型受容体（P2X）、または薬物のような脱感作受容体を標的とする薬剤は、確実に同じ組織に累積濃度応答曲線を使用してテストすることができません。これらのケースでは、単一の濃度は、組織の異なるグループで試験する。脱感作を評価するためには、累積濃度の終わりに達成されるものと単一の最高濃度によって誘発される応答の大きさを比較することが推奨される応答曲線。 濃度応答曲線から得られたデータの正確なフィッティングのためには、半対数濃度（ 図6の例のCCh）をテストすることが望ましい。組織の生存率が制限される場合があり、または他の制約が生じていてもよいしかし、ログ濃度（ 図4Aの例NMB）が許容される。 新規化合物のための濃度範囲を選択するには、予備実験において、その濃度の上下10の化合物と試験つの電力の結合親和性を考慮することが有用である。その後の実験では、プロトコルは、薬物の影響は観察されない出発点と応答が最大でないか、試験した濃度は、もはや意図された標的に特異的であるいずれかのエンドポイントを決定するために精製される。 a）は時間のために：薬剤を適用するための時間間隔を考慮し、いくつかの要因を考慮して選択すべきである薬は効果があります。 （ - 3時間30分）細胞内標的（ 例えば 、フォルスコリンおよび他の酵素阻害剤36、ボツリヌス毒素37）のための薬剤は、追加のインキュベーション時間を必要とするのに対し、膜受容体を標的とする一般的な薬剤には、比較的速い応答（数秒から数分）を有している。さらに、組織の厚さが役割を果たし得る。 b）の期間、薬剤の作用機序。 図6において、図4Aおよびシサプリド、このようなNMBような薬物の効果が維持されるプラトーに達した場合は、、薬物アプリケーション間で5〜15分の時間間隔が十分なデータを収集するために適切である。これは薬が作用または異なる作用機序（ATP、のCCh）のはるかに短い期間を有するでは不可能である。例えば図4Cまたは4D内のCChの効果は、急速にプラトーに達したが、組織の緊張は、ベースラインに戻ろう。この場合、時間間隔は応じて調整する必要がある最初の応答が最大に達したときLYは、通常、次の濃度を添加する。 ストリップ間の比較を可能にするデータ分析、データの正規化は、特に非常に重要なステップである。別の研究では、別の収縮剤（ 例えば 、のCCh 38）への最大応答の最大応答28または％のストリップ体重38、ストリップ断面積39、塩化カリウム応答12％を含む、正規化のための異なるパラメータを使用しています。正規化パラメータは、パラメータは、試験化合物、病状または実験設計によって影響されないように、実験の目的に応じて選択すべきである。例えば、KClの応答に正規化は、重みとストリップの他の寸法がなくなり、したがって、病理学的状態は、ストリップの重量（ 例えば 、糖尿病、膀胱質量を増加させる）を増加させることができる組織における応答を比較するために使用することができる。また、再KClに対するsponseが粘膜/尿路上皮29の除去によって影響されない、したがって膀胱（平滑筋対、例えば 、粘膜）の異なる成分を評価する実験に使用することができる。 要約すると、この収縮法は、膀胱（および他の器官）生理学および薬理学を評価するための迅速、簡単かつ非常に強力なアプローチを提供します。適切に使用されるとき、それは減少し、よく制御された環境で組織を操作する能力を提供する。膀胱機能の研究では、この方法は、抗ムスカリン、現在、OABの管理のために使用される化合物の発見とテストに尽力し、新たに3 ARアゴニストβ開発しました。

膀胱平滑筋は、尿貯蔵及び契約は、尿排泄を誘発することができるように緩和する。リラクゼーションには、固有の平滑筋の特性によっておよび排尿筋におけるβアドレナリン受容体（ヒトにおけるβ3 AR）を活性化する交感神経からのノルエピネフリンの持続放出（NE）によって媒介される。排尿は、交感神経入力を抑制し、膀胱平滑筋1を収縮させるアセチルコリン/ ATPを放出する副交感神経を活性化することによって達成される。脳および/ ​​または脊髄損傷、神経変性疾患、糖尿病、膀胱出口閉塞または間質性膀胱炎を含む多くの病理学的状態は 、重度の生命2の患者の質に深刻な影響を与え、膀胱機能を変化させることができる。平滑筋、求心性または遠心性神経および/またはこれらの条件は、膀胱の1つ以上の構成要素に影響を与えることにより、平滑筋の収縮性を変化させる粘膜。 膀胱機能を研究するin vivoおよびin vitroの方法にはいくつか開発されている。 インビボでは 、膀胱内圧測定は、膀胱機能の主要な測定である。これは生理的条件に近い条件下での情報の収集を可能にする無傷製剤であるが、平滑筋ストリップの使用が優先される状況が多数ある。これらは、外科的および/ ​​または薬理学的操作は生存およびインビボでの製剤の安定性、または影響を与える状況を含む研究は、ヒト組織または高価な化学薬品の使用を必要とする場合。この方法はまた、膀胱の各コンポーネントに対する薬剤、年齢や病状の効果の検討を容易にする平滑筋、粘膜、求心性及び遠心性神経、すなわち 。 膀胱ストリップは、科学的な質問の数に答えるために、多くのグループによって長年にわたって使用されてきた。彼らは、エヴァに使用された病理学によって誘導された筋原自発活動のluate変化。この活動は、過活動膀胱（OAB）の緊急性と周波数の症状に寄与すると考えられ、したがって、OAB 3-9のために開発されて薬物のための標的である。膀胱ストリップはまた、イオンチャネルおよび/ ​​または平滑筋の弛緩または収縮のいずれかを誘導するために標的化され得る受容体および/ ​​または細胞内経路を発見する目的で、平滑筋緊張を調節する筋原性および神経因子を調査するために使用された3,10- 13。他の研究では、送信機及び受容体関与しており、病理14,15によって誘導された変更を含む、神経伝達の性質に焦点を当てている。さらに、この方法は、器官19-21、および薬物の構造活性相関の評価の22〜24の間、異なる種からの組織の16〜18間の比較のために使用されてきた。この方法の拡張は、MEASURするために使用されている遠心性神経25から伝達物質の放出に対する薬物の効果を電子。さらに、組織（膀胱、尿道、消化管、GI）（研究のために承認手術または臓器ドナー組織からの）動物またはヒトから採取し、脊髄損傷（SCI）、膀胱出口閉塞などの動物モデルの多様から多様な（BOO）、または間質性膀胱炎（IC）は、この技術を使用して調べることができる。 本論文では、上記のいくつかの科学的問題に対処するために、必要な実験プロトコルと一緒に、このメソッドの使用例を示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Equipment</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Tissue Bath System with Reservoir</td>
			<td>Radnoti, LLC</td>
			<td style="width:119px;">159920</td>
			<td style="width:180px;">isolated tissue baths</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Warm water recirculator pump</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TPZ-749</td>
			<td style="width:180px;">to keep tissue baths to 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Computer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Data Acquisiton System</td>
			<td style="width:123px;">DataQ Instruments</td>
			<td style="width:119px;">DI-710-UH</td>
			<td style="width:180px;">To view, record and analyze data</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:180px;">Transducer amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Grass stimulator</td>
			<td style="width:123px;">Grass Technologies</td>
			<td>Model S88</td>
			<td style="width:180px;">Stimulator</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Anesthesia System</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td>ACV-1205S</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:237px;"><a name="RANGE!A10">Anesthetizing Box</a></td>
			<td style="width:123px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">500116</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Anesthesia Masks</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AC-09508</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Materials and surgical instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">sylgard</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:180px;">To pin, dissect &#38; cut tissue</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-152</td>
			<td style="width:180px;">To dissect/cut tissue</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:237px;">Insect Pins</td>
			<td style="width:123px;">ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins</td>
			<td style="width:119px;">Size 5</td>
			<td style="width:180px;">To pin tissue</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Bench Pad</td>
			<td style="width:123px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">56617-014</td>
			<td style="width:180px;">Absorbent bench underpads</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Rat surgical Kit</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INSRATKIT</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">2 Dumont #3 Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500064</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500092</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Scalpel</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500236</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Scalpel blade</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500239</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Professional Clipper&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">CLP-223&#160;45</td>
			<td style="width:180px;">To remove fur</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Suture Thread</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">18020-50</td>
			<td style="width:180px;">Tie tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Tissue Clips</td>
			<td>Radnoti, LLC</td>
			<td style="width:119px;">158802</td>
			<td style="width:180px;">Attach tissue to rod/transducer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">1g weight</td>
			<td style="width:123px;">&#160;Mettler Toledo</td>
			<td>11119525</td>
			<td style="width:180px;">For transducer calibration</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Chemicals</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="170">
			<td height="170" style="height:170px;width:237px;">Krebs Solution:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium Chloride 
			Potassium Chloride 
			Monobasic Potassium Phosphate 
			Magnesium Sulfate 
			Dextrose 
			Sodium Bicarbonate 
			Calcium Chloride 
			Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Fisher 
			Fisher 
			Fisher 
			Fisher 
			Sigma 
			EMD 
			Baker</td>
			<td style="width:119px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; S7653 
			P217-500 
			P285-3 
			M65-500 
			D16-500 
			S5761 
			CX0130-2 
			2444</td>
			<td style="width:180px;">To prepare Krebs solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">029405</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">&#160;Oxygen tank</td>
			<td style="width:123px;">Matheson Tri Gas</td>
			<td style="width:119px;">ox251</td>
			<td style="width:180px;">To use with anesthesia system</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Matheson Tri Gas</td>
			<td style="width:119px;">Moxn00hn36D</td>
			<td style="width:180px;">To aerate Krebs solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology

私たちは、 インビトロ膀胱平滑筋の収縮性を測定する方法、及び生理学的および薬理学的な平滑筋の特性ならびに病理学によって誘導された変化を調査するためのその使用を記載している。この方法は、外科的および薬理学的調製物の安定性および生存に影響を与える操作が、ヒト組織の使用、および/ ​​または高価な化学物質の使用のようなin vivo実験において遭遇する主要な方法論的な困難を克服しながら膀胱機能を理解するための重要な情報を提供する。また、健康的で病的状態で各袋コンポーネント（ すなわち 、平滑筋、粘膜、神経）の特性を調べるための方法を提供します。 膀胱は、麻酔した動物から取り出しクレブス溶液中に入れ、ストリップに切断される。ストリップは温かいKrebs溶液で満たされたチャンバ内に配置されている。一端はアイソメトリックtensioに取り付けられている収縮力を測定するためのn個のトランスデューサ、他端が固定されたロッドに取り付けられている。組織を直接浴にまたはインビボで膀胱収縮をトリガーに似神経を活性化する電場刺激電極によって化合物を添加することによって刺激される。個々の膀胱の成分の役割は、平滑筋活性の調節に関与する因子、発達中および実験的脊髄損傷後の神経伝達（関連する送信機および受容体）の性質を自発的平滑筋収縮性を評価するために、この方法の使用を実証する、と種との薬理学的薬剤に応答して、臓器の違い。さらに、それは伝達物質の放出の収縮および/または平滑筋の弛緩、薬物の構造活性相関評価に関与する細胞内経路を調査するために使用することができる。 in vitroでの平滑筋収縮法がfoは広く使用されている50歳以上のR、および大幅に膀胱機能の理解にも同様に、現在膀胱管理のために臨床的に使用される化合物の医薬開発に貢献したデータを提供してきました。

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Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

この原稿は、薬理学的薬剤または神経刺激に応答して平滑筋収縮性を評価するためのインビトロの方法で 、シンプルでありながらパワフルなを提示します。主な用途は、薬物スクリーニングと理解組織生理学、薬理学、病理学である。

下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

bladder-smooth-muscle-strip-contractility-as-method-to-evaluate-lower

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

26.1K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. この原稿は、薬理学的薬剤または神経刺激に応答して平滑筋収縮性を評価するためのインビトロの方法で 、シンプルでありながらパワフルなを提示します。主な用途は、薬物スクリーニングと理解組織生理学、薬理学、病理学である。 

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Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

マウスの膀胱壁インジェクション

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

医学

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, and persistent nerve and muscle impairments after hospital discharge.1-6 Using an explicit protocol with a structured approach to training and quality assurance of research staff, manual muscle testing (MMT) is a highly reliable method for assessing strength, using a standardized clinical examination, for patients following ARDS, and can be completed with mechanically ventilated patients who can tolerate sitting upright in bed and are able to follow two-step commands. 7, 8 
This video demonstrates a protocol for MMT, which has been taught to &ge;43 research staff who have performed &gt;800 assessments on &gt;280 ARDS survivors. Modifications for the bedridden patient are included. Each muscle is tested with specific techniques for positioning, stabilization, resistance, and palpation for each score of the 6-point ordinal Medical Research Council scale.7,9-11 Three upper and three lower extremity muscles are graded in this protocol: shoulder abduction, elbow flexion, wrist extension, hip flexion, knee extension, and ankle dorsiflexion. These muscles were chosen based on the standard approach for evaluating patients for ICU-acquired weakness used in prior publications. 1,2.

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and critical illness frequently develop long-lasting muscle weakness. Manual muscle testing (MMT) is a standardized clinical examination commonly used to measure strength of peripheral skeletal muscle groups. This video demonstrates MMT using the 6-point Medical Research Council scale.

徒手筋力テスト：四肢筋力の測定方法は、危篤状態の患者に適用

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Method to Measure Tone of Axial and Proximal Muscle

The control of tonic muscular activity remains poorly understood. While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance of relaxed limbs1, no systems are available to study tonic muscle control in a natural, active state of antigravity support. We have developed a device (Twister) to study tonic regulation of axial and proximal muscles during active postural maintenance (i.e. postural tone). Twister rotates axial body regions relative to each other about the vertical axis during stance, so as to twist the neck, trunk or hip regions. This twisting imposes length changes on axial muscles without changing the body's relationship to gravity. Because Twister does not provide postural support, tone must be regulated to counteract gravitational torques. We quantify this tonic regulation by the restive torque to twisting, which reflects the state of all muscles undergoing length changes, as well as by electromyography of relevant muscles. Because tone is characterized by long-lasting low-level muscle activity, tonic control is studied with slow movements that produce "tonic" changes in muscle length, without evoking fast "phasic" responses. Twister can be reconfigured to study various aspects of muscle tone, such as co-contraction, tonic modulation to postural changes, tonic interactions across body segments, as well as perceptual thresholds to slow axial rotation. Twister can also be used to provide a quantitative measurement of the effects of disease on axial and proximal postural tone and assess the efficacy of intervention.

We have developed a device (Twister) to study the regulation of tonic muscle activity during active postural maintenance. Twister measures torsional resistance and muscular responses in standing subjects during twisting of the body axis. The device can be flexibly configured to study various aspects of tonic control across the neck, trunk, and/or hips.

軸方向および近位筋のトーンを測定する方法

The control of tonic muscular activity remains poorly understood.  While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance ...

Probe-based Confocal Laser Endomicroscopy of the Urinary Tract: The Technique

Probe-based confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces during standard endoscopy. With applications currently in the respiratory1 and gastrointestinal tracts,2-6 CLE has also been explored in the urinary tract for bladder cancer diagnosis.7-10 Cellular morphology and tissue microarchitecture can be resolved with micron scale resolution in real time, in addition to dynamic imaging of the normal and pathological vasculature.7
The probe-based CLE system (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, France) consists of a reusable fiberoptic imaging probe coupled to a 488 nm laser scanning unit. The imaging probe is inserted in the working channels of standard flexible and rigid endoscopes. An endoscope-based CLE system (Optiscan, Australia), in which the confocal endomicroscopy functionality is integrated onto the endoscope, is also used in the gastrointestinal tract. Given the larger scope diameter, however, application in the urinary tract is currently limited to ex vivo use.11 Confocal image acquisition is done through direct contact of the imaging probe with the target tissue and recorded as video sequences. As in the gastrointestinal tract, endomicroscopy of the urinary tract requires an exogenenous contrast agent&mdash;most commonly fluorescein, which can be administered intravenously or intravesically. Intravesical administration is a well-established method to introduce pharmacological agents locally with minimal systemic toxicity that is unique to the urinary tract. Fluorescein rapidly stains the extracellular matrix and has an established safety profile.12 Imaging probes of various diameters enable compatibility with different caliber endoscopes. To date, 1.4 and 2.6 mm probes have been evaluated with flexible and rigid cystoscopy.10 Recent availability of a &lt; 1 mm imaging probe13 opens up the possibility of CLE in the upper urinary tract during ureteroscopy. Fluorescence cystoscopy (i.e. photodynamic diagnosis) and narrow band imaging are additional endoscope-based optical imaging modalities14 that can be combined with CLE to achieve multimodal imaging of the urinary tract. In the future, CLE may be coupled with molecular contrast agents such as fluorescently labeled peptides15 and antibodies for endoscopic imaging of disease processes with molecular specificity.

Probe-based confocal laser endomicroscopy enables real-time microscopy of the human urinary tract during cystoscopy, providing dynamic, intravital imaging of pathological states such as bladder cancer with cellular resolution. Endomicroscopy may augment the diagnostic accuracy of standard white light endoscopy and provide intraoperative image guidance to improve surgical resection.

尿路のプローブベースの共焦点レーザーEndomicroscopy：テクニック

Probe-based  confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology  that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

尿中エキソソームを単離するために、修正沈殿法

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

マウスの膀胱痛に対するモデルとしての膀胱膨満誘発内臓運動応答

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

血管平滑筋細胞と大動脈石灰化と炎症のイメージングの石灰化

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

援助医薬品開発への人間の子宮平滑筋の収縮力測定

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ion channels and electrogenic pumps that regulate Vm in disease conditions could potentially alter Vm, vascular tone, and blood flow. Thus, a basic understanding of electrophysiology and the methods necessary to accurately record Vm in healthy and diseased states are essential. This method will allow modulating Vm using different pharmacological agents to restore Vm. Although there are several methods, each with its advantages and disadvantages, this article provides protocols to record Vm from cannulated resistance vessels such as the middle cerebral artery using the microelectrode impalement method. Middle cerebral arteries are allowed to gain myogenic tone in a myograph chamber, and the vessel wall is impaled using high resistance microelectrodes. The Vm signal is collected through an electrometer, digitized, and analyzed. This method provides an accurate reading of the Vm of a vessel wall without damaging the cells and without changing the membrane resistance.

The primary goal of this article is to provide details of how to record membrane potential (Vm) from the middle cerebral artery using the microelectrode impalement method. The cannulated middle cerebral artery is equilibrated to gain myogenic tone, and the vessel wall is impaled using high resistance microelectrodes.

中大脳動脈から膜電位を記録する微小電極浸入法

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

平滑筋細胞系譜トレース マウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...