電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

感応色の光記録法は、脳の働き方を可視化する理想的な技術と考えられています。この方法は、精神的な活動に関する見解を与えられ、12時間以上にわたって神経精神動態を安定的かつ確実に記録することを可能にした。母に対する貴重な酸塗布など、開発全段階で化学物質による回路変化を検出するアプリケーションを拡大しようとしています。

この技術はすでに十分に確立されています。ここで紹介する方法に従って、研究を再現してみてください。この手順を開始するには、切断された頭部を氷の冷たいACSFにステンレス鋼の外科用トレイに浸します。

1分以内に脳を抽出し、5分間冷やしたACSFを含むビーカーに入れます。次に、メスで中線の脳部を分割し、4%寒天ブロックに両方の半球を配置します。次に、両半球の脳ブロックを4%寒天ブロックに置きます。

余分な ACSF をフィルタ ペーパーでブロックから拭き取ります。その後、バイブレーションのプラットフォームにスーパーグルーを適用します。寒天ブロックを置き、過剰な接着剤を濾紙で拭きます。

優しく余分なスーパーグルーを固め、接着剤が脳を覆い、スライスを乱すことを防ぐために、脳寒天ブロックの上から氷冷ACSFの少量を適用します。その後、プラットフォームをビブラートメトレーに固定し、変更されたACSFを注ぎます。ビブラートを低速に設定し、ブレード周波数を最大設定にします。

その後、スライスを開始します。スライスの順序を簡単に区別できるように、スライスチャンバーの隅にスライスを順番に配置します。通常、1つの半球から3〜5枚のスライスを得ることができます。

次に、30ゲージ針を用いて脳幹部分を切断する。小さな先端のペイントブラシを使用して、プレキシガラスリングで保持されている膜フィルターの上にスライスを置きます。リングを湿った回復室に置き、カバーを固定して内圧を高く保ちます。

スライスを膜フィルターに配置する場合は、リング内のスライスの方向と位置を調整して、適切に中央に配置され、一貫した方向を持つようにします。標本を摂氏28度に30分間放置し、室温で少なくとも10~30分間放置して回収します。スライスを染色するには、各スライスに100マイクロリットルの染色液をそっと塗布し、室温で20分でインキュベートします。

次に、50~100ミリリットルのACSFを容器に入れる。試料を入れたリングを入れ、染色液をすすきます。次に、すすったスライスを別のインキュベーションチャンバーに移します。

実験の前に回復のために1時間以上待ちます。この手順を開始するには、アンプ、コンピュータ、カメラシステムの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。50ミリリットルのチューブにACSFを注ぎ、カルボーゲンで泡立て。

ACSFを循環させ、流量を毎分約1ミリリットルに調整するために蠕動ポンプを使用してください。次に、実験室内部の液位が常に一定になるように吸引ピペットの高さを調整する。地面電極をチャンバーに置きます。

続いて、ガラス電極に少量のACSFを充填し、電極ホルダーに入れます。ホルダをマニピュレータのロッドに取り付けます。アンプを使用して、電極抵抗がおよそ1メガオームであることを確認してください。

録音セッションでは、湿ったチャンバから実験室にスライスを移します。リングの端をしっかりとシリコンOリングに押し込みます。膜や実験室の底部を壊さないように注意してください。

顕微鏡下では、刺激電極の先端と電界電位記録電極をスライスに配置します。刺激を提供することによって、呼び起こされる応答を確認します。視野が光学記録システムの右の神経回路を覆っていることを確認します。

次に、励起光強度をカメラの最大容量の約70~80%に調整します。蛍光光源を使用して、集録システムで焦点を調整します。そして、記録を開始し、取得後の画像取得ソフトウェアのデータを分析する。

この図は、マウス海馬スライスの領域CA1におけるシャファーコラテロールの電気刺激時の代表的な光信号を示す。これらの連続した画像は、任意の容量フィルタと時間フィルタが適用される前に光信号を示し、これらの画像は5/5〜5立方フィルタを2回適用した後、同じデータを示しています。高いフレームレートと高い空間分解能のために、フィルタの適用は信号を変更しませんでしたが、単一の試行でピクセルで記録された時間コースでも観察できるノイズを除外しました。

ここでは、マウスとラットの海馬スライスの領域CA1の典型的な応答の比較です。小さな過分極応答は、マウス海馬スライスで24ミリ秒後にCA1の遠位側で観察されるが、より大規模な過分極応答はラット海馬スライスの脱分極応答を追い越した。スライスが染色されると、それらは12時間以上続く必要があり、あなたはそれらに他の電気生理学的録音を行うことができます。