Метод оптической записи с чувствительным к напряжению красителем считается идеальной технологией для визуализации работы мозга. Этот метод позволил нам зафиксировать нейропсихическую динамику в течение 12 часов, что дало нам представление о психической активности. Мы пытаемся расширить применение для обнаружения изменений цепи, вызванных химическими веществами на всех этапах развития, таких как ценное применение кислоты для матерей.
Техника уже хорошо зарекомендовала себя. Пожалуйста, попробуйте воспроизвести исследования, следуя методу, представленного здесь. Чтобы начать эту процедуру, погрузите обезглавленную голову в ледяной ACSF в хирургический лоток из нержавеющей стали.
Извлеките мозг в течение одной минуты и поместите его в стакан, содержащий охлажденный ACSF в течение пяти минут. Затем разделите секцию мозга в средней линии скальпелем и поместите оба полушария на блок 4%агара. Затем поместите блок мозга с обоими полушариями на блок 4%agar.
Протрите излишки ACSF из блока фильтровальной бумагой. Впоследствии нанесите суперклей на вибромную платформу. Поместите агар блок на него и протрите чрезмерное клей с фильтровальной бумагой.
Аккуратно нанесите небольшое количество ледяного ACSF из верхней части блока агара мозга, чтобы помочь укрепить избыток суперклея и предотвратить клей от покрытия мозга и тревожные нарезки. После этого зафиксировать платформу к виброме лоток и залить модифицированный ACSF. Установите вибром на медленной скорости и иметь частоту лезвия на максимальной настройке.
Тогда начните нарезку. Поместите ломтики в углу среза камеры в последовательности, так что порядок ломтиков можно легко отличить. Обычно три-пять ломтиков можно получить из одного полушария.
Затем, отрезать часть ствола мозга с помощью 30 калибровочных иглы. Используя небольшую наконечником кисть краски, поместите ломтик на мембранный фильтр, удерживаемый с плексигласовым кольцом. Поместите кольцо во влажную восстановительную камеру и закрете крышку, чтобы держать внутреннее давление высоким.
При размещении ломтик на мембранный фильтр, настроить направление и положение ломтик в кольцо, чтобы убедиться, что он хорошо по центру и имеет последовательное направление. Оставьте образец при температуре 28 градусов по Цельсию на 30 минут, а затем при комнатной температуре, по крайней мере, от 10 до 30 минут для восстановления. Чтобы испачкать ломтики, аккуратно нанесите 100 микролитров раствора окрашивания на каждый ломтик и инкубировать при температуре 20 минут для комнатной температуры.
Затем приготовьте от 50 до 100 миллилитров ACSF в контейнере. Поместите кольцо с образцом в нем, чтобы промыть окрашивание раствора. Затем перенесите промытые ломтики в другую инкубационую камеру.
Подождите более часа для восстановления перед экспериментом. Чтобы начать эту процедуру, включите усилитель, компьютер и камеру системы и открыть программное обеспечение. Налейте ACSF в 50 миллилитровую трубку и пузырь его карбогеном.
Используйте перистальтический насос для циркуляции ACSF и корректировки скорости потока примерно до одного миллилитра в минуту. Затем отрегулируйте высоту всасывающей пипетки так, чтобы уровень жидкости внутри экспериментальной камеры всегда был постоянным. Поместите наземный электрод в камеру.
Впоследствии заполните стеклянный электрод небольшим количеством ACSF и поместите его в держатель электрода. Прикрепите держатель к стержню манипулятора. Используя усилитель, убедитесь, что сопротивление электрода составляет примерно один мегаом.
Во время записи перенесите кусочек из влажной камеры в экспериментальную камеру. Прижимай край кольца твердо в силиконовое о-кольцо. Будьте осторожны, чтобы не сломать мембрану или нижней части экспериментальной камеры.
Под микроскопом поместите кончик стимулирующего электрода и поле потенциальной записи электрода на ломтик. Проверьте вызванный ответ, поставляя стимул. Подтвердите, что поле зрения охватывает правильную нейронную цепь в оптической системе записи.
Затем отрегулируйте интенсивность возбуждения света примерно до 70-80% от максимальной емкости камеры. Используя флуоресцентный источник света, отрегулируйте фокус с системой приобретения. Затем начните запись и проанализируйте данные в программном обеспечении для получения изображений после приобретения.
На этом рисунке показан репрезентативный оптический сигнал при электрической стимуляции шаффер-колламерола в области CA1 мышелового гиппокампа. Эти последовательные изображения показывают оптический сигнал, прежде чем какие-либо пространствевые и временные фильтры были применены в то время как эти изображения показывают те же данные после применения пять на пять кубических фильтров в два раза. Из-за высокой частоты кадров и высокого пространственного разрешения, применение фильтра не изменило сигнал, но отфильтровыв шум, который также можно наблюдать в ходе времени, записанного в пикселях в одной пробной версии.
Вот сравнение типичных ответов в области CA1 гиппокампа ломтиками между мышью и крысой. Небольшая гиперполярная реакция наблюдается в дистальной стороне CA1 после 24 миллисекунд в ломтике гиппокампа мыши, но более массивный гиперполяризирующий ответ догнал деполяризирующий ответ в ломтике гиппокампа крысы. После того, как ломтики окрашены, они должны длиться более 12 часов, и вы можете выполнять другие электрофизиологические записи на них.
