臍帯血ユニットからの造血幹細胞のエクスビボ拡張は、再生医療および移植療法におけるHSCの適用に大きな約束を果たす。このプロトコルは、バルプロ酸処理と組み合わせたサイトカインカクテルを使用して、原始原始HSCに近い特性を持つ多数の機能性HSCを急速に拡大します。
この方法は、現在使用されている遺伝子改変プロトコルに関連する期間内に、より多くの遺伝子組み換え細胞を生成するのに有益である可能性があります。バルプロ酸ex vivo拡張プロトコルは比較的簡単で信頼性の高いプロトコルです。細胞分離器装置を用いたCD34陽性細胞の精製は、非常に再現性が高く、迅速であり、高度に精製されたCD34陽性細胞の迅速な回収を可能にする。
臍帯血からCD-34陽性細胞を単離する24時間前に、0.5モルEDTAの2ミリリットルと7.5%BSAの33ミリリットルを1X PBSの465ミリリットルに加えて分離バッファーを調製する。緩やかに緩やかに混ぜ、摂氏4度で一晩維持します。精製の日には、メディアを室温まで温めます。
臍帯血ユニット全体を75平方センチメートルのフラスコに分配する。室温でPBSの等しい量で血液を希釈し、穏やかに混ぜます。次に、臍帯血ユニット全体の処理に必要な管数を決定する。
各チューブに15ミリリットルの濃度勾配培地を加えます。希釈した血液を密度勾配の上に非常にゆっくりと分配し、チューブを45度の角度で保持して2つの層を作成します。400gでチューブを30分間遠心し、加速と減速速度が低い。
遠心分離後、単核細胞は、プラズマと密度勾配培地層の間の白層に位置する。慎重に新しい、50ミリリットルのチューブにバフィーコート層を転送します。同じ臍帯血単位から25ミリリットルに達するまで、すべての単核細胞を50ミリリットルのチューブに集めます。
25ミリリットルの単核細胞を含むチューブに25ミリリットルの冷たいPBSを加え、よく混ぜます。400gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を慎重に吸引し、50ミリリットルの冷たいPBSで細胞ペレットを再懸濁する。
この後、カウント用の細胞懸濁液の20マイクロリットルを取り除く。自動化された細胞カウンターを使用して、アクリジンオレンジまたはヨウ化プロピジウムのいずれかで染色された細胞の数をカウントし、単核細胞の総数を計算します。その後、細胞を400gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心する。
まず、300マイクロリットルの分離バッファーをヒトFCRヒトIgGの100マイクロリットルと100マイクロリットルのCD34磁気ビーズと混合し、1000万個の単核細胞からCD34陽性細胞を単離する。次に、以前遠心分離された単核細胞のチューブから上清を慎重に除去する。1000万個の細胞あたり500マイクロリットルを使用して、磁気ビーズ溶液中のペレットを再懸濁します。
穏やかに混ぜ、摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーション中に、貯蔵溶液を作業バッファーに置き換え、洗浄プログラムを実行し、続いてリンスプログラムを実行して、セル分離装置を準備します。次に、冷たいセル分離器の実行バッファーを、その細胞混合物を含むチューブに、チューブが完全に充填されるまで追加します。
チューブを400g、摂氏4度で15分間遠心します。上清を吸引し、1000万個の細胞あたり2ミリリットルを使用して、冷たい分離器のランニングバッファー内の細胞ペレットを再懸濁する。2ミリリットルの細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。
3セットのチューブをセルセパレータラックに積み込み、4°Cに予め冷却します。チューブの1セットにはMMCsが含まれ、2番目のチューブセットは負の分数を収集するために使用され、3番目のセットのチューブは精製されたCD34陽性細胞を収集するために使用されます。ラックをセル分離装置にロードし、事前設定プログラムを実行します。
この後、正の分率を含むチューブを400gで400g、摂氏4度で15分間遠心する。上清を吸引し、精製したCD34陽性細胞を1ミリリットルの無血清培地で再懸濁する。次に、自動化された細胞カウンターを用いて、アクリジンオレンジまたはヨウ化プロピジウムで染色された細胞を数える。
まず、精製したCD34陽性細胞を1ミリリットル当たり33,000細胞の密度でプレートするのに十分な量の培地を調製する。精製したCD34陽性細胞を12ウェルプレートに12ウェルプレートに入れ、1.5ミリリットルの培地で50,000細胞の細胞密度をプレートします。5%の炭酸ガス加湿インキュベーターで摂氏37度で16時間インキュベートします。
最終濃度が1ミリモルになるように培養物にバルプロ酸を加える。さらに7日間同じ条件で細胞を培養し続ける。このex vivoプロトコルでは、臍帯血から分離したCD34陽性細胞から生成される原始造形幹細胞の数が増加する。
有核細胞の総数は、サイトカインカクテル単独で処理した培養において有意に高い。総有核細胞の数が多いにもかかわらず、サイトカインカクテルを単独で受け取る培養物の造血幹細胞の数は、サイトカインカクテルおよびバルプロ酸で処理された培養物と比較して、全体の拡大期間中に低いままである。造血幹細胞の最大数は、サイトカインカクテルとバルプロ酸の組み合わせで処理された培養で生成されます。
特に、バルプロ酸による処理の5~7日後に最大の膨張に達する。この造血幹細胞の増加数は、造血幹細胞の割合の迅速な増加と相関し、バルプロ酸による処理の24時間以内に顕著である。この割合の増加は、エキビボ培養の最初の4日間は維持されるが、5~7日間の治療後に徐々に減少する。
しかし、この減少は造血幹細胞の絶対数の増加と逆相関している。バルプロ酸処理培養における造血幹細胞の割合の急激な増加は、CD90表現型の獲得によるものです。CD90表現性マーカーを発現するCD34陽性細胞は、サイトカインカクテルとバルプロ酸で4日間処理したエクスビボ培養で増殖した細胞のほぼ40〜50%に達する。
CD90表現型の獲得は、CD90マーカーの発現を欠く高精製CD34陽性細胞のex vivo増殖によって確認される。バルプロ酸による処理の24時間以内に、エクスビボの拡張細胞のほぼ75%がCD90を発現する。この表現型は、これらの培養の最初の4日間に高く保持されています。
希釈された臍帯血は、2つの異なる層を作成するために45度の角度でチューブを保持しながら、密度勾配の上に非常にゆっくりと分配する必要があります。このex vivo拡張手順に従って、拡張細胞を骨髄性免疫欠損NSGマウスに注入して、その機能性および生着ポテンシャルを試験することができる。拡張された細胞は、ヒトとマウスの両方のHSCの生物学とHSCの機能的完全性に関する異なる遺伝子または重要なプレーヤーの役割に関する様々な質問をテストするために使用することができます。
この技術を用いてヒト臍帯血ユニットからHSCを拡大したex vivoの機能は、同種骨髄移植を必要とする血液学的悪性腫瘍患者の臨床試験ですぐに試験される。この技術はまた、VPA治療を用いてex vivo拡張の基礎となるメカニズムを調査し、原始的なHSCの生物学に関する洞察を得ることを可能にしました。
