SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96ウェルのロングプライマーPCR <ol><li> -80℃の冷凍庫でプレ凍結96ウェルPCRクーラー。 </li><li>プレート当たり2415マイクロリットルの総容積のために、のddH 2 O 2100μlを、105μlのPCRグレードのDMSO、105μlの10 mMのdNTPを、105μlのPPOTテンプレート（25 ngの/μl）を9：10 mlチューブでは、マスターミックスAを準備。 </li><li>アリコートを96ウェルPCRプレートの各ウェルに23μL。 </li><li> P20の12チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用してもロードされた各プライマーをプールし、100μMの2μLを加えます。あらかじめ冷却PCRクーラーにフィルム、場所板をシールし、-80℃で20分間の最低凍結することができます。 </li><li> 10ミリリットルのチューブでは、マスターミックスBを用意：2048μlののddH 2 O、525μlの10×緩衝液、プレート当たり2626マイクロリットルの総容量52.5μlのポリメラーゼ。 </li><li> -80°Cの冷凍庫からプレートおよびPCRクーラーを取り外します。 </li><li> PCRクーラー上の静止プレートと、フリーズの上に25μlのマスターミックスBを追加nはマスターミックスAを50μlの総反応容量のために。これは重要な時期であり、そしてミックスAを解凍する前に完了する必要があります。フィルムでプレートをシール。 </li><li> 94℃を10分間7分間72℃での最終伸長期間に続いて2分間30秒15秒94℃の30サイクル、65℃、72℃、その後、次のようにサーマルサイクラーを設定します。 。 </li><li>ブロックが94℃に達した後、PCRプレートをロードします。 </li></ol> 96ウェルのロングプライマーPCRの2検証<ol><li>ウェルの4行のゲルを得るために、4×28ウェルコームとトリス酢酸EDTA（TAE）ランニング緩衝液中で大きな1％（w / v）アガロースゲルをキャスト。 12チャンネルのマルチチャンネルピペットの先端に櫛の代替歯の位置を合わせます。レーンがロードされた後、慎重にTAEランニング緩衝液にゲルを浸します。 </li><li> 1 番目と28 番目のウェルの各列にロード1 kbのDNAラダー。 </li><li> P20 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを用いて、PCR産物でdirの2μLを移しますectlyゲル（ 図1A）の各レーンへ。アンプリコンを汚染する可能性を低減するために迅速にこれを行います。 <ol><li> （ - レーン3、A2 - レーン5 ...... A11 - レーン23、A12 - A1レーン25）ゲルの1行目の奇数番号のレーンにPCRプレートのA列からのPCR産物をロードし、PCR産物をロードゲルの1 行目の偶数番号のレーンにPCRプレートの列Bから（B1 -レーン4、A2 -レーン6 ...... B11 -レーン24、B12 -レーン26）。 </li><li>偶数レーンにレーン番号、行D奇数に列Cと、上記のように同じパターンを使用して、PCRプレートの列CおよびDからのPCR産物を読み込みます。 PCRプレートの各ウェルは、ゲル上にロードされるまで、この負荷パターンを続けます。 DNAローディングバッファーは、このゲルをロードする必要はありません。 </li></ol></li><li>ランニングタンクにゲルを置き、ゲルが水没するまでバッファを実行しているTAEでタンクを埋めます。 30分間100 Vで実行し、UVトランスイルミネーターを使用して視覚化します。例えばゲルについては、 図1Bを参照してください。 注：PCR産物は、数週間前、トランスフェクションのために-20℃で保存することができ</li></ol> 3. 96ウェルトランスフェクション<ol><li> T.を使用しますトリパノソーマ procyclicフォーム細胞株は、この手順のためSMOXP9 10とFCS 10 10％を含むSDM-79培地中で増殖。 </li><li>トランスフェクションあたり1×10 7細胞を使用してください（1.1×10 9細胞の合計）Nタンパク質の末端およびトランスフェクションあたり2×10 7細胞にタグ付け（2.2×10 9細胞の合計）のC末端にタグ付けタンパク質。トランスフェクションの前に数日間中間対数（1.2×10 6 -1×10 7細胞/ ml）で細胞を維持し、5-8×10 6細胞/ mlの密度で、トランスフェクションのために細胞を回収。 </li><li>トランスフェクションのための冷凍PCR産物を室温で解凍することができます。 </li><li>ヘムを用いて細胞を数えますocytometerまたは自動セルカウンター。 </li><li>ペレットを10分間、800×gで、複数の50 mlのチューブ内のセルの数を必要としました。 </li><li>遠心廃棄上清後で、cytomix（0.8mMのEGTA、24 mMのKClを修飾10ml中に0.15ミリモルのCaCl 2、10mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.6、25mMのHEPES-KOH pH7.6、2.6ミリモルのMgCl 2を 、細胞を再懸濁チューブあたり0.5％（w / v）のグルコース、100μg/ mlのBSA、1mMのヒポキサン​​チン、144 mMのスクロース）。単一の管に、すべてのセル・ソリューションを移し、10分間、800×gで再びスピン。 </li><li>遠心分離後、上清を廃棄し、5×10 7細胞/ mlの最終濃度のために修飾cytomix 23 ml中に細胞を再懸濁。 </li><li>細胞が回転している間に、4×24ウェル組織培養プレートの各ウェルにSDM-79培地1mlを加えます。プレートのADにラベルを付け、プレートの向きを助けるために永久的なマーカーで各プレート上の周りにもA1をリングを描きます。 </li><li>エレクトロポにプレートハンドラーを接続します。 electropora上器ユニットは、1500 Vへの電圧、100マイクロ秒のパルス長と12へのパルス数と、500ミリ秒のパルス間隔を設定します。プレートハンドラーでは、これは、そのエレクトロはエレクトロポレーションプレートの12列のそれぞれに単一パルスを印加するようになります1にパルス数を設定します。 </li><li> P200 12チャンネルマルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルの使い捨てエレクトロポレーションプレートを、4mMのギャップにPCRプレートからPCR反応を転送します。 </li><li>細胞は、紡糸されており、5×10 7細胞/ ml（ステップ3.7）の最終濃度に再懸濁されたときに、試薬容器に移します。ピペットP200 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを用いて、エレクトロポレーションプレートの各ウェルに細胞溶液200μlを、ピペッティングによりPCR産物と混合します。 </li><li>組織を使用することにより、短絡を回避するために、プレートの上から任意の液滴を除去します。 </li><li>エレクトロポレーションプレートの上に板パッケージに設けられたシールフィルム、POSを適用各列の上部と下部に覆われていない電極用の穴を残すようにそれをitioning。フィルムを導くために使用される隆起した点をカバーすることは避けてください。 </li><li>プレートハンドラーへのエレクトロポレーションプレートをロードし、蓋を閉じます。エレクトロユニットを押し「パルス」。 </li><li>エレクトロポレーション後、すぐに4×24ウェル組織培養プレートに96ウェルエレクトロポレーションプレートから細胞を移します。細胞を転送するには、他のすべての先端が欠けているとP200 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用するように、残りの6つのヒントは、24ウェル組織培養プレート上の6行と列に並ぶこと。 24ウェル組織培養プレート（ 図2A）に予め定義されたパターンで、96ウェルエレクトロポレーションプレートでエレクトロポレーションした細胞を移します。 </li><li> P200のピペットチップを準備 - 各96ウェルのトランスフェクションのために除去他のすべての列と96のヒントの2箱を準備します。 <ol><li> 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送ウェルA1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11へプレート24ウェル組織培養プレートの列A、B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11列Bに、C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11行のCおよびD1 / D3 / D5 / D7へ行D.へ/ D9 / D11 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転送後、96ウェルプレート中のウェルは、その後で対応するウェルから培地で洗浄されています24-ウェルプレートの洗浄は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li><li> 24ウェルプレートB列Aに96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送ウェルE1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11、F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11列Bに、G1 / G3 / G5 / 96でのG7 / 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転写後行D.に行のCおよびH1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11へG9 / G11、井戸型ウェルプレートを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li><li> 24ウェルプレートのC列A、B2 / B4 / B6 / B 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送のウェルA2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12列Bに、C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 C列と96から6ウェルの各セットの転写後行D.へD2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12には、 24ウェルプレートに型ウェルプレートは、96ウェルプレート中のウェルを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li><li> 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送井戸E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24ウェルプレートD列AにB行に、F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12、G2 / G4 / G6 / 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転写後行D.に行のCおよびH2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12にG8 / G10 / G12、96のウェル型ウェルプレートを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li></ol></li><li>倒立位相差顕微鏡を用いて、細胞を確認するために、各列のウェル1を調べます。で生細胞と死細胞の混合物があるでしょう細胞破片のかなりの量。それらは位相差顕微鏡の下で明るくなり、移動されるので、生細胞を死細胞と区別することができます。 </li><li>タイトなシールを形成する蓋付きの清潔な、プラスチック製の箱に24ウェルプレートを置きます。 28℃のインキュベーターにボックスを置きます。 </li><li>後で時間6-8との間には、各ウェルに2倍の選択抗生物質を含む10％FCSをSDM-79の1ミリリットルを追加します。我々の経験では、遺伝子はN末端にタグ付けされた細胞株は、選択薬剤の高い濃度に対して耐性です。したがって、一例としてブラストサイジン用いて、N末端にタグ付けすることを20μg/ mlのブラストサイジンの最終濃度を必要とし、C末端にタグ付けを10μg/ mlのブラストサイジンの最終濃度を必要とします。 注：トランスジェニック細胞株を9-10日、トランスフェクション後に見えるようになります。 </li><li>少なくとも2倍、新鮮な薬剤やメディアでの分析の前に通過。 図2Bは、典型的な96ウェルtransfeからの結果を示しますN末端に96の異なるタンパク質をタグ付けするためのction。それは健康、薬剤耐性細胞が含まれているかどうかを判断するために、位相差顕微鏡により各ウェルを評価します。健康だけでなく、位相契約顕微鏡で明るく、主に（&lt;95％）高活性の細胞が含まれています。落射蛍光顕微鏡法またはウェスタンブロットによるその後の分析は、タンパク質が正常にタグ付けされているかどうかを決定する必要があります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. 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M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

最後の5年から10年におけるプロテオミクスとトランスクリプトミクスの方法の感度の劇的な改善は、遺伝子およびそれらの製品の何千もの貴重なデータを提供してきました。しかし、これらのタンパク質の機能に対応するためのツールが追いついていません。 タンパク質のタグ付けは、その機能を決定するために多くの実験を容易にします。例えば、タンパク質は、局在化および共局在研究を容易にするために、異なる色の様々な蛍光タンパク質に融合することができます。このようなAPEX2やminiSOG 11,12などの電子顕微鏡用に開発されたタグ、タグタンパク質の超微局在を可能にします。このようなTAPタグ、およびProtC-TEV-PROTA（PTP）などの生化学用のタグは、7,13は、結合パートナーの同定のためまたはインビトロ生化学アッセイでタンパク質と結合した複合体の精製を可能にするタグ。 protocの成功に重要である特定の手順、PCRマスターミックス1へのDMSOの取り込みマスターミックス2、マスターミックス2の商業ポリメラーゼの使用とcytomixエレクトロポレーションバッファの変更を加える前に、PCRマスターミックス1の凍結：オールがあります。我々の経験では、陽性ウェルの類似の比率を達成するために、N末端タグのトランスフェクションのためのように、C末端タグのトランスフェクションのための細胞の二重の数を使用する必要があります。記載されているようにそのため、すべてのステップを実行する必要があります。 この技術は、昆虫procyclicフォームトリパノソーマをトランスフェクションする際に成功する唯一の可能性があります。血流フォームは低いトランスフェクション効率14を持って、しかもそれらが原因で、選択薬とは無関係の密度依存毒性に選択中に死亡する可能性があります。したがって、我々の以前のプロトコルは、血流フォームトリパノソーマ9のタグ付けのための現在の最高の技術を表しています。また、トランス、その可能性がありますフェクション効率は、特定のトリパノソーマの分離株に依存して変化するであろう。他の株は、追加の最適化を必要とするかもしれない - このプロトコルは927 SMOX procyclicフォームを使用して最適化しました。成功の確率を高めることができる対策は、次のとおり、PCRアンプリコンの量を増加させるトランスフェクションに含まれるセルの数を増加させます。 我々は、タンパク質の数百を並列にタグを付けることができます方法を提示します。これは、既存の大規模なデータセットを補完し、コミュニティに貴重な情報を提供し、局在との相互作用に大規模な研究を促進します。プライマーテンプレートは、リクエストに応じて利用可能であり、プラスミドテンプレートのリストは、から入手できます。http://www.sdeanresearch.com/

トリパノソーマは 、ウシにおける人間のアフリカtrypanosomasisとナガナ病を引き起こす寄生原虫である。T.トリパノソーマは 、高品質のゲノム、多数のプロテオミクスおよびトランスクリプトームデータセットとよく発達した分子ツール1-3の組み合わせにタンパク質機能の解析のための理想的な生物です。プロテオミクスおよびシーケンシングの進歩は、潜在的に興味深い遺伝子4-6ハイライト表示し、大規模なデータセットをもたらしています。しかし、多くの遺伝子は、既存のデータベースに、それらに関連する最小限の情報を持っています。タンパク質の機能的特徴付けを支援するためのハイスループット法が必要とされています。 タグ付けされたタンパク質の発現は、タンパク質の機能への洞察の多様性を与えることができます。例えば、蛍光タンパク質またはエピトープでタグ付けされたタンパク質は、protのについての情報を提供する、蛍光顕微鏡によってローカライズすることができますEINはその生物学的効果を発揮する可能性があります。また、TAP 7でタグ付けされたタンパク質は、HaloTag 8またはHisタグは、生化学的ア ​​ッセイおよびその相互作用パートナーの同定のために精製することができます。 我々は最近、T.ための堅牢なタグ付けの方法論を開発しましたトリパノソーマ 9。これは、トランスフェクションのためのDNAを生成するために、長いプライマーPCRを使用し、並列中のタンパク質の数十のタギング許可 - 既存のプロトコルへの主要な改善を。我々は今一桁procyclic形で、このプロトコルの拡張性を改善しています。ここでは、回復と選択が24ウェルプレート内で発生して、96ウェルプレートに我々の我々は、PCRを行う方法およびトランスフェクションを示します。タンパク質の数百人が今並列にタグを付けることができますように、この方法は、全体トリパノソーマゲノムをタグ付けするための費用対効果や実現可能な方法を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td style="width:167px;">desalt only (do not use additional purification)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">Included with the Expand HiFi pack</td>
			<td>Must be PCR grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP</td>
			<td style="width:115px;">any reputable</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand HiFi polymerase</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11759078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BTX ECM830</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HT-200 plate handler</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">HT-200</td>
			<td>Handles the 96-well eletroplates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MOS 96 ELECTROPLATE 4mm</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">45-0452</td>
			<td>Electroplate for the 96-well electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Melford</td>
			<td style="width:119px;">3513-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin b Gold</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phleomycin</td>
			<td style="width:115px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P0187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24 well culture plates</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Eppendorf&#174; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well Multiply&#174; PCR plate with lateral skirt</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.1979.203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

この代表的なトランスフェクションでは、プライマーはTagItのperlスクリプト9を使用して設計され 、商業的に合成しました。 96ウェルPCRを行うと説明した （ 図1A）のように検証されました。この例では、96分の95のPCR（ 図1B）に成功しました。我々の経験では、成功したPCRにはなりません元のプライマーまたは再合成されたプライマーを用いたいずれかの障害が発生した反応を繰り返します。 アンプリコンは、エレクトロポレーション（ 図2A）のための96ウェルエレクトロポレーションプレートに移し、次いで、回収および選択のための24ウェル培養プレートに移しました。選択が起こることを可能にするのに十分な時間の後、ウェルを、さらなる分析の前に、生存のために記録しました。この例では、96分の88ウェル（92％）は、15日間の選択後に陽性でした。 <imgのALT = &quot;図1&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; 図1：PCRの検証のために、アガロースゲルに96ウェルPCRプレートからPCR産物を転送するための長いプライマーPCR（A）パターンの検証 。 （B）N末端 ​​に95の遺伝子をタグ付けするための代表的な96ウェルPCR検証ゲル、およびトランスフェクションにおけるネガティブコントロールとして機能するように、5 &#39;標的と相同性を含まない1アンプリコン。サンプルは、1％（w / v）アガロースゲルにロードし、30分間100Vで解決されている<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> 図2：96ウェルエレクトロポレーションおよび選択 96ウェルエレクトロポレーションPLATのエレクトロポレーションした細胞を転送するための（A）パターン。24ウェル組織培養プレートに、E。 （B）24ウェルプレートにおける選択の15日後に典型的な生/死得点を模式的に示します。グリーンはグレーのみ死細胞とよく表して、成功したトランスフェクションを表します。この例では、ウェルの96分の88（92％）が正常にトランスフェクトされた寄生虫が含まれています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K ビュー.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ビデオ: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

のテロメアG -オーバーハング構造の検討トリパノソーマ</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

免疫・感染学

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...