特に組織イメージング実験では、カルシウムイメージング実験から大量のデータを取得する能力が大幅に向上しました。このプロトコルは、これらのデータセットを定量化して記述するための適切な分析手法を記述しています。私たちのプロトコルは、組織全体のカルシウムシグナル伝達に固有の空間値、時間値、強度値の範囲を生成し、これはより初歩的な分析で失われる可能性があります。
イメージングの1時間前に、カハルまたはICCの間質細胞を持つマウスから採取した小腸を、遺伝子組み換えカルシウム指標をスピニングディスク共焦点顕微鏡の段階に特異的に発現させる。そして継続的に摂氏37度のクレブスリンガー重炭酸塩またはKRB溶液で組織を浸透させる。60〜100 X倍率を使用して、小腸の円形および縦平滑筋層の間に星状の心腸叢ICCまたはICC-MYを配置する。
次に、円形の平滑筋層と粘膜下神経叢の間の単一平面内のスピンドル形の深部筋叢ICCまたはICC-DMPを見つけ、TIFF画像のスタックとしてムービーを保存します。ICC-DMPカルシウムアクティビティの時間的マップまたはSTMを作成するには、ImageJで画像スタックを開き、[画像]、[タイプ]、[32ビット]をクリックして画質を変更します。ライン スキャンを作成するには、ライン選択ツールを右クリックし、セグメント化された線分を選択します。
左クリックを 1 回使用すると、個々の ICC-DMP の中に線が引き込まれます。[イメージ、スタック、再スライス]を選択します。ポップアップ ウィンドウが表示されます。
ライン スキャンの方向を左から右に向ける場合は、[90 度回転] を選択して、ライン スキャンの位置を左から右に調整し、X 軸の時間と時間を合わせて読み取り、y 軸上のスペースを持つ時間に合わせて読み取り、[OK] をクリックします。時空間マップが表示されます。マップからカルシウム信号の振幅を正確に測定するには、長方形の選択を選択し、蛍光の最も均一で最も強い領域を表示するSTM内の領域の周りに関心のある領域を描画します。[解析とヒストグラム]をクリックして、選択した対象領域内の強度の平均値を取得し、[編集]、[選択]、[すべて選択]をクリックして STM 全体を選択します。
次に、[処理]、[数学]、および [除算] をクリックし、選択した STM 領域を含む強度の平均値をポップアップ ボックスに入力します。STM は黒に変わります。ポップアップウィンドウで[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト]、[自動]をクリックして、これを修正します。
線スキャンは、蛍光をゼロで割った蛍光の強度で振幅に合わせて調整されます。STM は、TIFF スタック内のフレーム数を x 軸に、y 軸のセルの長さを表すピクセル数を表示します。カルシウム信号から時間データと空間データを定量化するには、[画像とプロパティ]をクリックし、適切な値を入力して、スペースと時間のSTMをポップアップウィンドウで完全に調整します。
個々のカルシウムイベントを分析するには、[直線]をクリックし、STM上をクリックしてドラッグして、X軸に平行なカルシウムイベントの中心を通って直線の水平線を描きます。次に、[プロファイルの分析とプロット]をクリックします。カルシウムイベントのプロットプロファイルを示すボックスが表示されます。
ICC-MYカルシウムシグナリングデータの粒子ベースの解析では、ムービーファイルをボリューム測定で開き、右クリックしてSTKフィルタを選択し、差別化します。もう一度右クリックして、区別する値を入力します。[Enter]を押して左クリックし、差別化を開始します。
パーティクルを作成するには、マウスの中央ボタンを使用してムービーをスクロールし、静止期間を含む 20 ~ 40 フレームのセクションを選択し、続いてカルシウム過渡クラスターとクラスターの直後に続く 20 ~ 40 フレームを選択します。すべてのフレームが選択されている場合、ムービーウィンドウで右クリックして STK OPS ランプ DS パーティクル情報にアクセスし、最大強度から最小強度までしきい値を段階的にランプするパーティクル解析ルーチンを実行します。パーティクル分析を成功させるには、非活動性のカルシウム過少前クラスターをできるだけ多く組み込み、カルシウム後過渡クラスターをできるだけ多く組み込むことを確認してください。
これは、信号対雑音比を高めるのに役立ちます。解析は、ノイズのプロットとしてプロットウィンドウにグラフィック表示され、粒子の数を表す緑色のトレース、平均粒子サイズを表す赤いトレース、絶対強度しきい値を表す青いトレースを持つ 3 つのカラートレースとしてトレースウィンドウに表示されます。ヒストグラムのバランスを取るために、キーボードのHを押して、パーティクルノイズのプロットを調整します。
次に、右角かっこキーを押して、背景が白色になるまで配色を切り替えます。キーボードの F キーを 1 回押して、測定ツールを起動します。次に F キーを 2 回押して、色付きプロットが右側にシフトし始める交差点のプロットのトレース ウィンドウのスクロール バーの 1 本の垂直線をマークします。
トレース ウィンドウ内で、マウスの中ボタンを使用して、赤いトレースの変曲点からマークされた白い垂直線までスクロールします。表示された Y 平均を確認した後、トレース ウィンドウ内でマウスの中央ボタンをもう一度クリックして、青いトレースの選択を解除します。ムービーウィンドウで C をクリックしてカラーホイールを表示し、D をクリックしてしきい値を調整します。
有効なパーティクルは赤色で表示され、飽和したパーティクルは白色になります。マウスの左ボタンを使用して白い領域が削除されるまでスクロールし、中央マウスボタンを使用してカラーホイールの黄色の数値を Y 平均値に調整し、決定されたしきい値点でアクティブなカルシウム過渡粒子として赤ですべてを割り当てます。データを座標ベースのパーティクル ファイルとして保存するには、右クリックして STK 3D にアクセスし、パーティクル 0 を保存し、左クリックしてファイルを保存します。
パーティクル アクティビティ ヒート マップを作成するには、保存したパーティクル ファイルを開き、ムービー ウィンドウを右クリックしてパーティクル STKops、StatMap フラグにアクセスし、分析するフラグの割り当てを入力します。クリックすると、分析と、記録全体の発生率を表す異なる色で記録全体の全長のパーティクルの合計が示されるヒート マップが適用されます。右クリックしてヒート マップを TIFF ファイルとして保存します。
次に、ムービーウィンドウを右クリックして、パーティクルメジャーにアクセスし、パーティクルの統計 STK が等しく、解析のフラグ割り当てを入力します。トレース ウィンドウに一連のトレースが生成されます。STM 解析では、空間広がりや伝搬速度など、カルシウム信号の空間特性を監視および記録できます。
この情報を蓄積して、ネイティブ環境内の細胞内のカルシウムシグナル行動をかなり完全に把握することができます。粒子分析を用いて、カルシウムシグナルに関する定量的情報を粒子面積と粒子数を測定することによって計算することができ、これを併用して、指定された視野内でカルシウム信号活性化の空間範囲を決定することができる。粒子分析はまた、カルシウム焼成部位の位置および発火確率の検討を通じて細胞下カルシウムシグナル伝達の詳細な定量を可能にする。
パーティクルを時間特性に基づいて異なるフラグに割り当てることで、パーティクルのイニシエーションを正確にマッピングできます。そして、開始部位の数に関して取得された豊富なハードデータ、ピクセルおよびマイクロメートル単位のサイトのサイズ、各カルシウム過渡クラスター中に各開始部位が1回または複数回発射される確率、および各カルシウム過渡クラスターサイクル中に発射する発射部位の割合が得られる。このプロトコルで成功するための鍵は一貫性です。
すべてのデータセットとすべてのムービーは、信頼性が高く再現可能な結果を確実にするために、まったく同じ扱いを受ける必要があります。これは、パーティクル ファイルを扱う場合に特に当てはまります。当社のプロトコルは、その場でのカルシウムシグナル伝達の深い特徴付けを可能にし、適切に使用すると、様々な統計的方法を使用することで、空間的パラメータと時間パラメータの範囲の違いを評価することができます。
私たちのプロトコルのこれらの分析技術は、研究者が腸のペース作り、腸の内臓、ならびに下部尿路の神経制御に関する以前に対処できなかった質問を尋ね、答えることを可能にしました。
