<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface.">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li><li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells.">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li><li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment.">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+rafts+in+cell+membranes.">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-&#223;-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics.">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-&#223;-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+signal+transduction.">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li><li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling,+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins.">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li><li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity.">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li><li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco.">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li><li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation.">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li><li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li><li>Jouanneau, J. 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X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants.">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li><li>Olsen, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID,+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos.">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li><li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StatQuant:+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry.">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li><li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+wants+cRacker:+Automated+standardized+data+analysis+of+LC/MS+derived+proteomic+data.">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li><li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+of+remorins,+a+plant-specific+protein+family:+Evolutionary+and+functional+perspectives.">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li><li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondetergent+isolation+of+rafts.">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li><li>Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method.">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li><li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts.">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li><li>M&#252;hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. 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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。 著者、ヴィトルドスジーマンスキーは分子植物生理学のマックスプランク研究所の従業員である。著者は、ラウドシュルツはホーエンハイム大学、ドイツの従業員である。

本論文で提示プロトコルは、多くのステップが含まれており、それらのすべては、洗剤耐性膜と洗剤の可溶性画分に植物細胞膜の純粋で代表画を得ることが重要である。したがって、指示に従って、各ステップに従うことが重要である。 非イオン性界面活性剤（ステップ3.2）を用いて原形質膜画分の処理は、膜マイクロドメイン分別の品質に最も強い影響を有する。異なる製剤間で再現性のある結果を得るために、同じ実験からの異なるサンプルを比較することができるように、それが正確に原形質膜中のタンパク質の濃度を評価し、タンパク質含有量に対して同じ比で常に清浄剤を適用することが非常に重要である常に同じ最終濃度まで。実際に、それは時々、高いタンパク質濃度を有する試料を希釈する、または異なる濃度のストックを使用する必要があることを意味トリトンX-100の。 生化学的研究では、最近、膜マイクロドメイン28〜30の単離のために界面活性剤を含まない方法を使用する研究者の間で傾向があった。これらの方法は、フレンチ圧力セルプレスと同様に非常に小さな針を通して剪断により原形質膜の機械的破壊に基づいている。これらの手順は、正常膜マイクロドメインの豊富な哺乳動物細胞培養物に適用したが、生物（酵母、植物細胞）を含む細胞壁への応用が報告されていない。例えば、メチル-β-シクロデキストリンのようなステロール破壊剤と共に定量的プロテオミクスを用いて、それが植物原形質膜から調製されたDRM画分は、膜ミクロドメイン11のマーカーであるタンパク質を含まないことが示された。 質量分析定量化の最終的な結果について、 図6に示す典型的な結果では、理想的な状況を表すどのラベルおよび非標識ペプチドの大多数のためのイオン強度は同じに近い。しかし、場合によって標識し、非標識細胞培養物のセット間の生物学的変動のある程度を観察することができる。従って、標識および非標識対照細胞の混合物の標識又は非標識細胞培養が行われ、分析のいずれかの生物学的処理の前に、両方の任意の処理なしに、一つの状況に理想的なものからの発散比を有するペプチドの同定を可能にする。発散比でこれらのタンパク質は、生物学的変動の適応である。生物学的変動から区別する治療効果の課題を克服するために、我々は、したがって、対になった実験20で往復標識を使用することを提案する。逆数実験では、実験の両方の変異体は、図1に提案されているように実行され、説明されているように、プロトコルのステップが続く。そして、pは、イオン強度比を比較するイオン強度比の違いは生物学的変動、または適用される処理の効果とによるものである場合には逆数の実験の両方からroteins、人は区別することができる。 治療効果および生物学的変動とを区別する問題に対処するための別の方法は、全ての処理31の基準となる内部標識された標準の使用である。そのアプローチでは、非標識コントロールおよび生物学的治療を受ける非標識細胞は、同じバッチからの、重標識された対照細胞の同量と混合する。それは14 N-コントロール/ 15 N-対照および14 N-治療/ 15 N-コントロールのイオン強度比が著しく異なる場合、タンパク質は、有意であると見なされるため、ペプチド比に生物学的変動の影響を排除することができる。標識された標準は、全ての場合において正確に同じであるので、これは可能である。 DRの一つここで説明するDRMの濃縮手順のawbacks洗剤耐性膜画分に同定することができる同時精製タンパク質である。低密度界面活性剤耐性膜画分から同定されたタンパク質のリストでは、定期的にリボソームタンパク質を大量に観察することができます。によるリボソームタンパク質の比較的低い密度のために、それらは、ショ糖勾配におけるステロール依存性膜タンパク質として同じ画分に移行する。それは、リボソームタンパク質は明らかに膜マイクロドメイン11の構成成分ではないことを疑問なしで示された。これらの界面活性剤耐性、実際に低密度膜画分に関連付けられていない他の同時精製タンパク質を排除するために、我々は、2から下部デキストラン相から抽出することができる細胞内膜（IM）のプロテオミクス組成を分析することを提案相系と内膜とDRM間の推定される汚染物質の存在比を比較する画分（ 図5の例を参照してください）。 DRMで同時精製タンパク質は、両方の画分（IMおよびDRM）で同様の存在量を持つべきである。 細胞抽出物および膜マイクロドメインの分別は、プロテオーム解析のための32サンプル中の複雑さを低減する一般的な戦略である。したがって、ここで説明するプロトコルは、植物細胞の形質膜でシグナリングプロセスの全ての研究に有用である。生物学的用途は大幅に膜タンパク質14,15の原形質膜組成および変更の変化を誘発し、すべてのストレス反応だけでなく、病原体感染を研究している。ストレス反応を研究に加えて、別の膜画分中のタンパク質の存在量の定量が大幅に未知のタンパク質33 34,35の注釈を支援することができる。

1972年には、ジョナサン·シンガーとガースニコルソンは、一般的に1960年代初頭に受理されたタンパク質 - 脂質 - タンパク質サンドイッチモデルを置き換え、流動モザイクモデルの細胞膜の構造モデルを提案した。歌手とニコルソンは生体膜は、すべての脂質およびタンパク質の分子が自由に拡散し、容易に5二次元液体として考えることができると仮定した。その時以来、膜組成の原形質膜と知識の構造モデルがさらに複雑になった。特に、原形質膜内に、そのようなタンパク質複合体および脂質/ステロール基づいて構造的に無秩序なミクロドメインのような構造を観察することができる。人工モデル膜6,7において、ステロールおよびスフィンゴ脂質は、横方向に変化した物理的特徴を有する領域を形成するために、他の脂質種から分離することができる。細胞膜内でのこの分離は、主にステロールの高いSA間の自己会合特性によって引き起こされるphopshoとスフィンゴ脂質8の炭化水素鎖をturated。特に、剛性ステロールリングは、剛性がまっすぐ飽和脂質種との相互作用に有利とこれらの相互作用は、膜の厚さ及び硬度を高める、より拡張された立体配座に隣接する炭化水素鎖を強制。 ステロール濃縮膜マイクロドメインの一般的に観察特徴の一つは、非イオン性界面活性剤、トリトンX-100またはブリジ35で処理するとそれらの不溶性だった。これらの画分を膜マイクロドメインと同一であると考えられていたし、その生化学的製造法2に基づいて、洗剤耐性膜（DRM）と呼ばれていました。 DRM抽出中の非イオン性界面活性剤の使用は、生化学的なDRMの準備を直接生きた細胞9内の任意の特定の膜コンパートメントに対応しないことなど、いくつかの批判を受けた。特に、タンパク質の比洗剤は、このような調製において重要と思われる異なる界面活性剤だ、ならびに異なる界面活性剤の量は、界面活性剤耐性膜画分10の異なる組成物を得ることができる。しかし、特定のタンパク質種は、これらの特異的細胞性ステロールに富む膜ドメインに関連付けることを示す証拠があり、これらのタンパク質がよく界面活性剤耐性膜画分11の生化学的調製物において富化される。植物DRM画分に認められた、とのDRMでの存在が依存ステロールであったために、タンパク質のコアは、このようなファスシクリン様アラビノガラクタンタンパク質（のFLA）とのSKUタンパク質ファミリーのメンバーとして特にGPIアンカー型タンパク質であった。また、このような受容体様キナーゼまたはホスホリパーゼのようないくつかのシグナル伝達タンパク質は、11を発見された。これらの結果は、哺乳類の膜マイクロドメイン12,13に関する多くのプロテオミクス研究と一致している。また、植物のストレス応答14の文脈における膜マイクロドメインの役割のための証拠が増えている-16。 ここに記載されているプロトコルは、細胞膜マイクロドメインの分別のための堅牢な方法を提供し、特に、私たちは、ステロールが豊富な膜コンパートメント4,11,14のストレス誘発性の変化を描くことを可能にする界面活性剤濃度、タンパク質を使用しています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia (stock 25 % solution)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>010-03166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 10 &mu;m</td>
			<td>GL-Science</td>
			<td>5020-75010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol(PEG 3350)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>88276</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran T500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K15NO3</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-765-PK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac RVC 2-25</td>
			<td>Christ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures

原形質膜マイクロドメインは、脂質やステロール環境の物理的性質に基づいて特徴であり、プロセスのシグナル伝達に特定の役割を持っている。プロテオーム解析のための植物細胞からのステロールに富む膜マイクロドメインを抽出し、他の細胞区画からの汚染のために複数の準備手順とソースに主に困難な作業です。原形質膜は、植物細胞内のすべての膜の約5〜20％を構成し、従って、高度に精製された原形質膜画分の単離は困難である。頻繁に使用される方法は、95％の純度を有する1原形質膜小胞を生じるポリエチレングリコールおよびデキストラン中水性二相分配を伴う。原形質膜内のステロールに富む膜マイクロドメインは、アルカリ性pHで冷非イオン性界面活性剤での処置の際に不溶性である。この界面活性剤耐性膜画分は、で超遠心分離によりバルクプラズマ膜から分離することができるucroseグラデーション2。続いて、タンパク質は、メタノール/クロロホルム沈殿によってショ糖勾配密度の低いバンドから抽出することができる。抽出したタンパク質は、その後、脱塩し、最終的に、LC-MS/MSで分析トリプシン消化されます。ステロールに富むミクロドメインのための私達の抽出プロトコルは、 シロイヌナズナ細胞培養物からの清浄な界面活性剤耐性膜画分の調製のために最適化される。 我々は興味3の生物学的処理を以下の定量的な比較プロテオミクス研究のための唯一の窒素源としてK 15 NO 3とシロイヌナズナ懸濁細胞培養の完全な代謝標識を使用しています。関節タンパク質抽出のための標識および非標識細胞培養物の等量比を混合することにより、最終的な定量的結果についての準備段階の影響を最小限に維持される。また抽出時の材料の喪失は、コントロールと同じように処理サンプルの両方に影響を与えるDそのため、光とヒーブペプチドの比率は一定のままである。もう一方は対照4として機能する提案方法のいずれかで標識するか、または非標識の細胞培養は、生物学的処理を受ける。

代謝的に標識されたシロイヌナズナの細胞培養物を使用して提示プロトコルでは、植物組織（ステップ2は、2および図4）から、原形質膜を分離し、原形質膜内の界面活性剤耐性膜画分を濃縮することができる（ステップ3,3および図5）。その後、プロトコルは、これらの界面活性剤耐性膜画分（ステップ4）からのタンパク質の抽出、比較プロテオーム解析（ステップ5）のためのタンパク質の消化を可能にする。最後に、リン酸化ペプチド（ステップ8）のオプションの濃縮は、細胞シグナル伝達過程を研究する上で特に興味深い。最後のステップは、標識し、非標識細胞培養由来の膜画分中のタンパク質存在比の定量的データ分析（ステップ9、 図6）である。 2相系（ステップ2）、およびその後の遠心分離混合後の典型的な結果は、明確な色の上相とある緑は下相（ 図2）色。緑の葉緑体や他の内部の膜から膜小胞が低いデキストラン相に取り込まれている間に原形質膜小胞は、優先的に、上方のPEG相に関連付ける。色分離を観察することができない場合、ステップ2が正しく行われておらず、原形質膜は、膜内部のかなりの量で汚染されるであろう。原形質膜タンパク質の濃縮は、二相系の下相における形質膜画分およびタンパク質の少量のアリコートのプロテオミクス分析によって示すことができる。下相は、細胞の内膜が含まれています。例えば、このような受容体キナーゼタンパク質として特に代表的な既知の原形質膜タンパク質は、原形質膜画分（PM）および内膜（IM）を含有する下相画分（ 図4A）における低存在量で高い存在量を示した。高小胞体ショーのターンでは、既知のタンパク質内膜画分における存在量とは、原形質膜画分（ 図4B）においては観察されなかった。 界面活性剤耐性膜画分（工程3）のその後の濃縮は、理想的なケースでは、チューブの高さの略1/5 番目 （ 図3）低密度膜小胞の乳白色のリングの形成をもたらすであろう。タンパク質比（ステップ3.2）にトリトンX-100の濃度または界面活性剤の調整は、界面活性剤耐性および界面活性剤の可溶性画分への分離のために最適である場合には、追加の環は、勾配の下部において観察することができ、また、膜の塊が存在する低密度帯で。これらの場合において、タンパク質比又は合計の洗剤量に対する界面活性剤は、2つの膜ドメイン画分の再現可能な分離に必要な臨界ミセル濃度とは異なる。ここで説明するタンパク質比、のENRに最終的な界面活性剤濃度と洗剤を使用して例えばremorin（AT3G61260）27のような典型的なミクロドメインタンパク質のichmentはDRM画分の比較質量分析、洗浄剤可溶性画分（ステップ3.8）ならびに未分画血漿膜および内膜により確認することができた。 （ 図6A）、予想通りremorinタンパク質の最も高い存在量は、DRM画分に認められた。このようなABCトランスポーターAT1G59870（ 図6B）のような膜マイクロドメインには存在しないタンパク質は、DRM画分中の存在量の増加を示していない。最小量が可能であるが、また60Sリボソーム（ 図6D）からのATPアーゼF0複合体（ 図6C）とリボソームタンパク質（At1G001100）からこのようなミトコンドリアタンパク質（AT2G07707）のような典型的な汚染物質は、DRM画分が濃縮された豊かさを表示しないまだ特定され。 血漿中のタンパク質のリン酸化状態の質量分析の後、タンパク質存在量比標識及び非標識細胞培養物の膜画分を定量的に（ 図6）を区別することができる。 MSQuant（からの典型的な結果<a href="http://msquant.sourceforge.net/" target="_blank">msquant.alwaysdata.net</a> ）定量ウィンドウが同定されたペプチド（ 図6A）のほとんどのための一から一のイオン強度比を示すべきである。イオン強度比が著しく1:1逸脱有するそれらのペプチドは、差動標識および非標識細胞培養の間に調節されるよう考えられており、（ 図6C）適用される処理によって影響を受けたタンパク質へのマッチングの候補であるている。成功した代謝標識の良好な品質管理の共溶出で標識し、 図6BおよびDナノ-HPLC分離（ステップ9）での単一ピークとして非標識ペプチドのバージョンを示すように、両方。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig1.jpg"/&gt; 図1。完全に代謝標識し、非標識シロイヌナズナ培養細胞を用いた実験デザインには2種類の代謝標識実験戦略。模式図。実験者は、生物学的処理、あるいはその逆を受けるコントロールおよび15 N細胞（代謝標識）として14 Nのセル（ラベル）を使用することを決定するか。相反実験計画では、両方の変異体は、並行して行われる。 <img alt="図2" fo:content-width="5.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2.jpg" /> 図2。葉緑体および他の内部の膜がボットに関連付けられている間、ポリエチレングリコール（PEG）およびデキストランに基づく水性二相系のプラント膜小胞を分離するためのワークフローは、血漿膜小胞は、上部PEG相に分離遠心分離後のOMデキストラン相。上相をさらに洗浄して良好な精製を達成することができるだけでなく、材料のロスが大きくなる。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3.jpg" /> 図3。低密度膜画分を濃縮する。低密度界面活性剤耐性膜画分の濃縮のためのショ糖勾配の表現。低密度膜小胞バンドの晩遠心分離後の期待される場所が示されている。 <img alt="図4" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4.jpg" /> 図4。二相系での精製後の血漿膜タンパク質を濃縮する。正規化原形質膜（PM）及び内膜（IM）画分で測定したタンパク質についてのタンパク質イオン強度（A）原形質膜の典型的な公知の構成要素は、IM画分におけるよりもPM画分中のより高い存在量を示す。内膜の（B）ナチュラル公知の成分逆の挙動を示している。正規化のために、各タンパク質のイオン強度和は、サンプルあたりの総イオン強度の割合として表した、その後の反復の間に平均した。総イオン強度の画分は、その後、二つの治療の間の平均相対として表した。エラーバーは、独立して成長した細胞培養から3調剤の標準偏差を表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="5.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig5highres.jpg" sRC = &quot;/ files/ftp_upload/50535/50535fig5.jpg&quot; /&gt; 図5。 。測定された画分中の標準的なタンパク質マーカーの存在量は、プロットは、特定の細胞内コンパートメントに選ばタンパク質マーカー（ -ステロールが豊富なマイクロドメイン、PM -細胞質膜、IM -内膜、SP -可溶性タンパク質DRM）の正規化されたタンパク質イオン強度の分布を表す。 （A）remorinステロールが豊富な膜マイクロドメインのためのマーカーとして、（B）の ABC型輸送体ファミリータンパク質ステロール依存しないタンパク質の代表として、（C）は 、ミトコンドリアF0複合体のサブユニット、（D）60Sの存在パターン典型的な同時精製汚染物質としてのリボソームのサブユニット。正規化のために、各タンパク質のイオン強度和は、サンプルあたりの総イオン強度の割合として表した、その後の反復の間に平均した。全イオン強度の割合は、その後2トリートメントルーム、間の平均の相対で表したtments。エラーバーは、独立して成長した細胞培養から3調剤の標準偏差を表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig5large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6.jpg" /> 図6。ペプチドDNNLLGKの定量的タンパク質質量分析の期待される結果。ラベルおよび非標識シロイヌナズナ細胞からのタンパク質抽出物の1:1混合物からのペプチドの予測される1時01分、イオン強度比を示すMSQuantからのスクリーンショット。（A）のフルスキャンスペクトルを明確にラベルされた（右ピーク）およびm / z軸に対するペプチドの標識されていない（左ピーク）のバージョンを分離。モノアイソトピック質量と第同位体は青色のマークで示されている。（B）標識（青）ANペプチドの共溶出のdの非標識（赤色）のバージョン単一ピークとしてナノ-HPLCクロマトグラフィーの間。示差的に調節されたタンパク質の候補として1:5のイオン強度比を有するペプチドの（C）フルスキャンスペクトル（D逆相クロマトグラフィー1:1共溶出とは異なる比で）、タンパク質。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig6large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。

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Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

14.0K ビュー.  Max Plank Institute of Molecular Plant Physiology. ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。 

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Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

イムノブロット解析

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

生物学

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

から毒素誘導とタンパク質抽出フザリウム属属。</emプロテオーム研究>文化

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...