وقد تحسنت القدرة على الحصول على كميات كبيرة من البيانات من تجارب تصوير الكالسيوم بشكل كبير، وخاصة مع تجارب تصوير الأنسجة. تصف بروتوكولاتنا تقنيات التحليل المناسبة لتحديد مجموعات البيانات هذه ووصفها. بروتوكولاتنا تولد مجموعة من القيم المكانية والزمانية والكثافة التي هي جوهرية للإشارة الكالسيوم في الأنسجة بأكملها وهذا يمكن أن تضيع في التحليل أكثر بدائية المستندة.
قبل ساعة واحدة من التصوير نقل الأمعاء الدقيقة حصادها من الماوس مع الخلايا الخلالية من Cajal أو ICC التي تعبر على وجه التحديد عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا إلى مرحلة المجهر النقسج القرص الغزل. و باستمرار يغرس الأنسجة مع 37 درجة مئوية كريبس-رينغر بيكربونات أو حل KRB. باستخدام 60 إلى 100 X التكبير تحديد موقع ممتاز على شكل plexus myenteric ICC أو ICC-MY بين طبقات العضلات السلسة الدائرية والطولية من الأمعاء الدقيقة.
ثم حدد موقع الضفير العضلي العميق على شكل المغزل ICC أو ICC-DMP في مستوى واحد بين طبقة العضلات السلس الدائرية والصفعة الضفيرة دون المخاطية وحفظ الأفلام ككومة من صور TIFF. لإنشاء خرائط اعظمية أو STMs لنشاط الكالسيوم ICC-DMP افتح مكدس الصور في ImageJ، وانقر على الصورة والنوع و32 بت لتعديل جودة الصورة. لإنشاء خط المسح الضوئي بزر الماوس الأيمن فوق أداة تحديد الخط وحدد خط مجزأة.
باستخدام نقرات واحدة اليسرى رسم خط على طول الوصول منتصف من الفردية ICC-DMP، النقر المزدوج عندما تم تحديد الخلية بأكملها. حدد الصورة والمكدسات والعيد. ستظهر نافذة منبثقة.
حدد تدوير 90 درجة لتوجيه مسح الخط من اليسار إلى اليمين بحيث يمكن معايرته وقراءته في الوقت على المحور س مع مساحة على المحور ص وانقر فوق موافق. سوف تظهر الخريطة الوشقية الزمانية. لقياس سعة إشارات الكالسيوم من الخريطة بدقة، حدد التحديد المستطيل وارسم منطقة ذات أهمية حول المنطقة داخل STM التي تعرض المنطقة الأكثر تناسقًا والأقل كثافة من الفلور. انقر فوق تحليل و الرسم البياني للحصول على قيمة متوسطة للكثافة داخل المنطقة المحددة من الاهتمام وانقر فوق تحرير، تحديد، حدد الكل لتحديد STM بأكمله.
بعد ذلك، انقر فوق معالجة، الرياضيات والقسمة وأدخل القيمة المتوسطة للكثافة مع منطقة STM المحددة التي تهم في المربع المنبثق. سيتحول الـ(ستم) إلى اللون الأسود قم بتصحيح هذا بالنقر فوق الصورة، الضبط، السطوع/التباين، والسيارات في النافذة المنبثقة.
سيتم الآن معايرة مسح الخط لاتساع مع شدة الفلوريسنس التي تم التعبير عنها كـ الفلوريسكين مقسوماً على الفلوريسينتر الصفري. سيتم عرض STM عدد الإطارات في مكدس TIFF على المحور س وعدد بكسل يمثل طول الخلية على المحور ص. لتحديد حجم البيانات الزمنية والمكانية من إشارات الكالسيوم انقر فوق صورة وخصائص وأدخل القيم المناسبة لمعايرة STM كاملة للمساحة والوقت في النافذة المنبثقة.
لتحليل أحداث الكالسيوم الفردية انقر فوق Straight Line وانقر واسحب على STM لرسم خط أفقي مستقيم عبر وسط حدث الكالسيوم موازياً لمحور س. ثم انقر فوق تحليل و ملف تعريف الرسم. سيظهر مربع يعرض ملف تعريف الرسم لحدث الكالسيوم.
لتحليل الجسيمات المستندة إلى بيانات إشارات الكالسيوم ICC-MY، افتح ملف الفيلم في Volumetry وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد STK Filter، تمييز. انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى لإدخال قيمة للتمييز. اضغط على Enter وانقر بزر الماوس الأيمن لبدء التمييز.
لإنشاء الجسيمات، استخدم زر الماوس الأوسط للتمرير خلال الفيلم لتحديد مقطع إطار 20 إلى 40 يتضمن فترة هادئة، متبوعاً بحدوث كتلة عابرة الكالسيوم و 20 إلى 40 إطارًا يتبع مباشرة بعد الكتلة. عندما تم اختيار جميع الإطارات بزر الماوس الأيمن في نافذة الفيلم للوصول إلى STK OPS Ramp DS معلومات الجسيمات وانقر لتشغيل روتين تحليل الجسيمات التي سلالم تدريجيا عتبة من الحد الأقصى إلى الحد الأدنى كثافة. لضمان تحليل الجسيمات الناجحة، تأكد من أن تقوم بتضمين أكبر قدر من قبل الكالسيوم العابرة كتلة غير نشاط، وبقدر ما بعد الكالسيوم عابرة كتلة غير نشاط ما تستطيع.
وهذا سوف يساعد على زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سيتم عرض التحليل بيانيا في نافذة المؤامرة كما مؤامرة من الضوضاء وفي نافذة آثار كما آثار ثلاثة لون مع تتبع الأخضر الذي يمثل عدد من الجسيمات، التتبع الأحمر الذي يمثل متوسط حجم الجسيمات، واللرق الأزرق الذي يمثل عتبة كثافة المطلقة. إلى توازن الرسم البياني مؤامرة من الضوضاء الجسيمات اضغط H على لوحة المفاتيح.
ثم اضغط على مفتاح القوس الأيمن للتنقل بين أنظمة الألوان حتى تكون الخلفية بيضاء مع آثار اللون في الأعلى. اضغط F على لوحة المفاتيح مرة واحدة لإحضار أداة قياس. ثم اضغط F مرة ثانية لوضع علامة على خط واحد عمودي في شريط التمرير من نافذة آثار على المؤامرة عند تقاطع حيث تبدأ المؤامرات الملونة للتحول إلى الجانب الأيمن.
داخل نافذة تتبع استخدام زر الماوس الأوسط للتمرير من نقطة انقلاب من التتبع الأحمر إلى خط عمودي أبيض ملحوظ. بعد الإشارة إلى متوسط Y المعروض، انقر فوق زر الماوس الأوسط مرة أخرى داخل نافذة التتبع لإلغاء تحديد التتبع الأزرق. في إطار الفيلم انقر فوق C لإحضار عجلة لون و D لضبط العتبة.
سيتم الآن عرض الجسيمات الصالحة باللون الأحمر، وتلك التي تشبع سوف تكون بيضاء. استخدم زر الماوس الأيسر للتمرير حتى تتم إزالة المناطق البيضاء واستخدام زر الماوس الأوسط لضبط القيمة الرقمية الصفراء في عجلة الألوان إلى متوسط القيمة Y لتعيين كل شيء باللون الأحمر كجسيمات عابرة الكالسيوم النشط عند نقطة العتبة المحددة. لحفظ البيانات كملف الجسيمات المستندة إلى إحداثي انقر بزر الماوس الأيمن للوصول إلى STK 3D، حفظ الجسيمات صفر، وانقر على اليسار لحفظ الملف.
لإنشاء الجسيمات نشاط الحرارة الخرائط فتح ملف الجسيمات المحفوظة وانقر بزر الماوس الأيمن في نافذة الفيلم للوصول إلى الجسيمات STKops، StatMap العلم وأدخل واجبات العلم لتحليل. انقر لتطبيق التحليل وخريطة الحرارة التي تبين الجسيمات الإجمالية لكامل طول التسجيل بألوان مختلفة تمثل نسبة الحدوث في جميع أنحاء التسجيل. انقر بزر الماوس الأيمن لحفظ مخطط الحرارة كملف TIFF.
ثم انقر بزر الماوس الأيمن في نافذة الفيلم للوصول إلى قياس الجسيمات ، وإحصائيات الجسيمات STK يساوي ، وأدخل واجب العلم للتحليل. سيتم إنشاء سلسلة من التعقب في نافذة التتبع. يوفر تحليل STM القدرة على رصد وتسجيل الخصائص المكانية لإشارات الكالسيوم، مثل الانتشار المكاني وسرعة الانتشار.
يمكن جمع هذه المعلومات لتوفير عرض كامل بدلا من الكالسيوم إشارات السلوكيات داخل الخلايا في بيئاتهم الأصلية. وباستخدام تحليل الجسيمات، يمكن حساب المعلومات الكمية المتعلقة بالإشارة إلى الكالسيوم عن طريق قياس منطقة الجسيمات وعدد الجسيمات، والتي يمكن استخدامها معا لتحديد النطاقات المكانية لتنشيط إشارة الكالسيوم ضمن مجال محدد من الرؤية. كما يسمح تحليل الجسيمات بالكمي المتعمق لإشارات الكالسيوم دون الخلية من خلال فحص الموقع واحتمالات إطلاق النار في مواقع إطلاق الكالسيوم.
من خلال تخصيص الجسيمات في أعلام مختلفة على أساس خصائصها الزمنية ، يمكن تعيين الجسيمات البادئة بدقة. وثروة من البيانات الثابتة التي تم الحصول عليها على عدد مواقع البدء، وحجم الموقع بالبكسل والميكروفيترات، واحتمال إطلاق كل موقع للبدء إما مرة أو عدة مرات خلال كل كتلة عابرة الكالسيوم، ونسبة مواقع إطلاق النار التي تطلق خلال كل دورة عنقودية عابرة الكالسيوم يمكن الحصول عليها. الاتساق هو مفتاح النجاح في هذا البروتوكول.
يجب معاملة جميع مجموعات البيانات وجميع الأفلام بنفس الطريقة لضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. هذا صحيح خصوصا عند التعامل مع ملفات الجسيمات. تسمح بروتوكولاتنا بتحديد عميق لإشارات الكالسيوم في الموقع ، ويمكن لمجموعة من الطرق الإحصائية ، عند استخدامها بشكل مناسب ، تقييم الاختلافات بين مجموعة من المعلمات المكانية والزمانية.
وقد سمحت تقنيات التحليل هذه في بروتوكول لدينا للباحثين لطرح والإجابة على الأسئلة التي لم يسبق لها معالجة والمتعلقة بتداخل ضربات القلب المعوية ، و القاعات المعوية ، فضلا عن السيطرة العصبية في المسالك البولية السفلى.
