このプロトコルは、健康および病理学における特定の器官における免疫細胞の役割を調査するのに役立つ。この手法の主な利点は、手作業の手法であるため、コスト効率の高い手法です。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、ジェンガン・ルオです。
まず、以前に安楽死させたマウスの胸腺と脾臓を20mlのシンチレーション・フィアル、または15mlの円錐形チューブに入れ、5mlのハンクのバランスのとれた塩溶液で満たします。膵水切りリンパ節を1mlのRPMI-1640で満たされたマイクロチューブ1.5mlに入れます。胸腺と脾臓全体、およびすべてのPDLNを使用してください。
全体の手順を通して氷の上に臓器を保ちます。はさみを使用して、胸腺と脾臓を十分に絞って免疫細胞を放出します。残りの胸腺と脾臓のカプセルを捨てます。
細胞懸濁液を15ml円錐状チューブに移します。433倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間、上清を捨てます。赤血球を溶出させるために、細胞懸濁液を0.2モル塩化アンモニウムの5mlで再懸濁し、室温で10分間インキュベートする。
チューブを2分おきにそっと反転します。インキュベーションの終わりに、5 mlのHBSSを加えて、リシスを止める。チューブを433倍g、摂氏4度で5分間遠心します。
上清を捨て、約5mlのHBSSで細胞を再懸濁する。次に、チューブをHBSSで満たします。サンプルを遠心分離からHBSSでチューブに充填するまで、このプロセスを1回繰り返します。
チューブを433倍gでもう一度、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、HBSS内のペレットを再び懸濁します。セルストレーナーキャップ付きの5mlラウンドボトムチューブを得ます。
細胞ストレーナーキャップに懸濁液を塗布することにより、胸腺細胞懸濁液1mlと脾臓細胞懸濁液500マイクロリットルをチューブに移す。まず、15mlの円錐形のチューブをラックに入れ、チューブの上に滅菌250マイクロメートルの金属メッシュを置きます。
RPMIの1 mlでメッシュをすすいでください。次に、リンパ節を金属メッシュに移し、ピンセットを使用してメッシュを通して粉砕します。細胞をチューブにフラッシュするために、メッシュに1mlのRPMIを適用します。
この工程を繰り返し、各サンプルに対してリンパ節を3回移し、粉砕し、メッシュを除去します。チューブを433倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、約5mlのRPMIで細胞を再懸濁します。
その後、RPMIでチューブを充填します。サンプルを遠心分離からRPMIでチューブに充填するまで、このプロセスを1回繰り返します。433倍gで再びチューブを遠心分離し、5分間摂氏4度でチューブを遠心分離します。
上清を捨て、細胞ペレットを2mlのRPMIで再び懸濁します。細胞懸濁液2mlをセルストレーナーキャップ付きの5mlラウンドボトムチューブに移します。まず、胸腺、脾臓およびPDLNサンプルからの細胞懸濁液を433倍g、摂氏4度で5分間遠心分離する。
上清を捨てます。テキストプロトコルに概説されているように表面抗体で細胞を染色し、氷上のチューブを40分間インキュベートします。次に、各チューブに200マイクロリットルのFACSバッファを加えます。
433倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間、上清を捨てます。このプロセスを繰り返し、バッファーを追加し、遠心分離し、上清を1回廃棄します。細胞ペレットを500マイクロリットルのパーメアビライズ固定バッファーに再懸濁し、細胞を固定し、透過させます。
チューブを一晩で摂氏4度で冷蔵庫に移します。翌日、チューブを433倍g、摂氏4度で5分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを500マイクロリットルのパーメビライゼーション洗浄バッファーに再懸濁させた。
再び433倍gで細胞を遠心分離し、摂氏4度で5分間、上清を捨てます。テキストプロトコルに概説されているように、細胞内抗体で細胞を染色する。氷上のチューブを1時間インキュベートします。
この後、各チューブに500マイクロリットルのパーメアビライズ洗浄バッファーを加えます。433倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を捨て、ペレットを500マイクロリットルのパーメビライゼーション洗浄バッファーに再懸濁させた。
遠心分離機は433倍gでもう一度、5分間摂氏4度で。上清を捨て、FACSバッファーの300マイクロリットルで細胞ペレットを再中断します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、フローサイトメーター上の細胞を解析します。
本研究では、単一細胞は、通常の血糖性NODマウスの胸腺、PDLNおよび脾臓から単一細胞を単離し、フロー細胞量分析のためにTreg細胞マーカー、CD4、CD25、Foxp3、Helios、およびニューロピリン-1で染色される。結果は分析され、代表的なギャティング戦略としてここに示されています。CD4陽性、CD8陰性、CD25陽性、Foxp3陽性のトレッグ細胞の中でのヘリオス陽性細胞の割合は、3つの器官すべてにおいてNrp1陽性細胞のそれよりも高いことが分かる。
胸腺のTreg細胞の80%以上が、PDLNおよび脾臓よりも高いヘリオスを発現することが見られる。ヘリオス陽性のTreg細胞の中でNrP1陽性細胞の割合は、胸腺または脾臓のいずれかのものよりもPDLNで高いことが見られます。Nrp1陽性のトレッグ細胞の大部分もヘリオスを発現し、Nrp1陽性トレッグ細胞のヘリオス陽性細胞の割合は、PDLNよりも胸腺および脾臓において高いことが分かる。
これらの結果は、HeliosがNrp1よりもTTreg細胞を検出するためのより良いマーカーであることを示しています。細胞はすでに染色され、死んでいるので、この手順の後に他の方法を実行することはできません。
しかし、動物の4つの細胞マーカーは、他のタイプの免疫細胞を研究するために置き換えることができます。
