يساعد هذا البروتوكول في التحقيق في دور الخلايا المناعية في أعضاء معينة في الصحة وعلم الأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هذه تقنية فعالة من حيث التكلفة لأنها تقنية يدوية. إثبات الإجراء سيكون تشنغكانغ لوه، طالب دكتوراه من مختبري.
للبدء، ضع الغدد الصماء والطحال من الفئران القتل الرحيم سابقا في 20 مل فيمحات التلألؤ، أو 15 مل أنابيب المخروطية، مليئة 5 مل من محلول الملح المتوازن هانك. ضع العقد اللمفاوية التي تستنزف البنكرياس في أنابيب صغيرة 1.5 مل مملوءة بـ 1 مل من RPMI-1640. تأكد من استخدام الغدة الصعترية والطحال كله، وجميع من PDLNs.
إبقاء الأجهزة على الجليد طوال العملية بأكملها. باستخدام زوج من مقص، والضغط بدقة الغدة الصعترية والطحال لإطلاق الخلايا المناعية. تجاهل كبسولات الزعتر والزبلين المتبقية.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 433 مرات ز و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من فائقة. لlyse خلايا الدم الحمراء، وإعادة تعليق تعليق الخلية في 5 مل من كلوريد الأمونيوم 0.2 الزبار، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.
عكس الأنابيب بلطف كل دقيقتين. في نهاية الحضانة ، أضف 5 مل من HBSS لوقف التحلل. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 433 مرات ز و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل المابير، وإعادة تعليق الخلايا في حوالي 5 مل من HBSS. ثم، ملء الأنابيب مع HBSS. كرر هذه العملية، من الطرد المركزي للعينات لملء الأنبوب مع HBSS، مرة واحدة.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير، وإعادة تعليق بيليه في HBSS. الحصول على 5 مل أنابيب مستديرة القاع مع قبعات خلية مصفاة.
نقل 1 مل من تعليق الخلايا الزعترة و 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المسيلة إلى الأنابيب عن طريق تطبيق التعليق على أغطية مصفاة الخلية. أولاً، ضع أنبوب مخروطي 15 مل في رف. ضع شبكة معدنية معقم 250 ميكرومتر فوق الأنبوب.
شطف شبكة مع 1 مل من RPMI. بعد ذلك، نقل الغدد الليمفاوية إلى شبكة معدنية واستخدام زوج من ملاقط لطحن لهم من خلال شبكة. تطبيق 1 مل من RPMI على شبكة لطرد الخلايا في الأنبوب.
كرر هذه العملية لنقل وطحن الغدد الليمفاوية ثلاث مرات لكل عينة، ثم قم بإزالة شبكة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افرا و إعادة تعليق الخلايا في حوالي 5 مل من RPMI.
ثم، ملء الأنابيب مع RPMI. كرر هذه العملية، من الطرد المركزي للعينات لملء أنبوب مع دورة في الدقيقة، مرة واحدة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل افرا وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من RPMI. نقل 2 مل من تعليق الخلية إلى 5 مل أنابيب مستديرة القاع مع أغطية مصفاة الخلية. أولاً، الطرد المركزي تعليق الخلية من الغدة الصعترية والطحال وعينات PDLN في 433 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل المُندفع. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة السطحية كما هو مبين في بروتوكول النص، واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من العازلة FACS إلى كل أنبوب.
أجهزة الطرد المركزي في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من فائقة. كرر هذه العملية، وإضافة المخزن المؤقت، وrifuging، وتجاهل ااسخاء، مرة واحدة. إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتررس من العازلة التثبيت Permeabilization لإصلاح و permeabilize الخلايا.
نقل الأنابيب إلى ثلاجة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. وفي اليوم التالي، تم تشغيل أجهزة الطرد المركزي في الأنابيب بمعدل 433 مرة ز وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولترات من عازلة الغسيل permeabilization.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 433 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق والتخلص من افرا. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة داخل الخلايا، كما هو مبين في بروتوكول النص. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة.
بعد هذا، إضافة 500 microliters من عازلة غسل permeabilization إلى كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 433 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من عازلة الغسيل permeabilization.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 433 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه الخلية في 300 ميكرولترات من العازلة FACS. ثم، تحليل الخلايا على جهاز قياس تدفق، كما هو موضح في بروتوكول النص.
في هذه الدراسة، يتم عزل الخلايا الفردية من الغدد الصماء، PDLNs والطحال من الفئران العادية إيماءة نسبة السكر في الدم، وملطخة مع علامات الخلايا Treg، CD4، CD25، Foxp3، هيليوس، وsoypilin-1 لتحليل تدفق الخلايا. يتم تحليل النتائج وتظهر هنا على أنها استراتيجيات تمثيلية لـ gating. نسبة الخلايا الإيجابية Helios بين CD4 إيجابية، CD8-السلبية، CD25 إيجابية، وينظر إلى خلايا Treg فوكسب3 إيجابية لتكون أعلى من الخلايا الإيجابية Nrp1 في جميع الأجهزة الثلاثة.
وينظر إلى أكثر من 80٪ من خلايا Treg في الغدة الصعترية للتعبير عن هيليوس، وهو أعلى مما هو عليه في PDLN، والطحال. نسبة الخلايا الإيجابية NrP1 بين خلايا Treg الإيجابية Helios تعتبر أعلى في PDLN من تلك الموجودة في الغدة الصعترية أو الطحال. غالبية خلايا Treg إيجابية Nrp1 أيضا التعبير عن هيليوس، ونسبة الخلايا الإيجابية هيليوس بين Nrp1 خلايا Treg إيجابية ينظر إلى أن تكون أعلى في الغدة الصعترية والطحال مما كانت عليه في PDLN.
معا, هذه النتائج تشير إلى أن Helios هو علامة أفضل للكشف عن الخلايا Treg T1 من Nrp1. العقد الليمفاوية صغيرة, ولكن بعض علامات داخل الخلايا تتطلب عددا كبيرا من الخلايا لإعطاء إشارة جيدة في تدفق الخلايا. لا يمكن تنفيذ أساليب أخرى بعد هذا الإجراء لأن الخلايا ملطخة بالفعل وميتة.
ولكن يمكن استبدال علامات الخلايا الأربع للحيوان لدراسة أنواع أخرى من الخلايا المناعية.
